Diagnostika stafylokoků P01 Diagnostika stafylokoků Mikrobiologický ústav LF MU Stafylokoky nGrampozitivní koky, nejčastěji ve shlucích tvaru hroznů, nepohyblivé n nRozdělení podle koagulace plazmy na n - koaguláza pozitivní (S. aureus) n - koaguláza negativní n n 58705-004-12AFD703 Staphylococcus Patogenní stafylokoky nStaphylococcus aureus nnázev z řeckého staphylé = hrozen n nJediný pro člověka běžně významný z tzv. koaguláza pozitivních stafylokoků nTento „zlatý stafylokok“ s oblibou způsobuje nhnisavé infekce kůže na kožních adnex, otravy nz potravin staphylococcus_aureus G:\Forunculo2.jpg S. aureus produkuje různé toxiny: Hemolyzin (a,b,g,d) – způsobují hemolýzu erytrocytů koaguláza – sráží krevní plazmu; znak patogenních stafylokoků fibrinolyzin – rozpouští fibrinové sraženiny leukocidin (PV toxin) – lýza leukocytů deoxyribonukleáza – znak patogenních stafylokoků enterotoxiny – jsou produkovány v potravinách; způsobují zvracení a průjmy hyaluronidáza – enzym, který produkují stafylokoky a usnadňuje invazivitu Další faktory virulence adherence (přilnutí), pouzdro (proti fagocytóze), tvorba biofilmu, PBP2a, enzymy degradující ATB beta-laktamázy aj. Abscesy n Na rozdíl od streptokoků, které vytvářejí ve tkáních zpravidla neopouzdřené flegmóny, tvoří stafylokoky spíše opouzdřené abscesy (dutina plná hnisu) hnisavé infekce měkkých tkání - abscesy hnisavé infekce ran G:\8_2.jpg G:\abscess-fig2.jpg hnisavé infekce tvrdých tkání - osteomyelitis G:\06.jpg G:\osteomyelitis.jpg infekce močových cest infekce dýchacích cest, pneumonie bakteriémie a sepse katétrové infekce krevního řečiště infekce a dalších implantátů - biofilm Stafylokokové superantigeny 2 upr TSST-1 (toxin syndromu toxického šoku) - způsobuje toxický šok Některé kmeny produkují enterotoxiny entrotoxikóza (intoxikace bakteriálním toxinem se, na rozdíl od střevní infekce, projeví velice rychle; obvykle také rychle odezní) Exfoliativní toxiny (epidermolyziny) - stafylokokový syndrom opařené kůže C:\Documents and Settings\Filip\Dokumenty\Obrázky\a.jpg Toxiny Stafylokoky s nízkou patogenitou n-nejběžnější z tzv. koaguláza negativních stafylokoků (CoNS) je Staphylococcus epidermidis (30 – 90 % izolátů) n-další, klinicky významní CoNS: S. saprophyticus, S. hominis, S. haemolyticus, S. warneri, S.sciuri,S. capitis, S. lugdunensis n-Koaguláza negativní stafylokoky jsou součástí normální mikroflóry, zejména kůže n-v poslední době jsou velice významnými původci infekcí u oslabených osob, zejména nemocničních nzpůsobují: - infekce moč. cest (S. saprophyticus) n - bakteriémie a sepse n - katétrové infekce krevního řečiště infekce a dalších implantátů - biofilm Léčba nU stafylokoků je lékem volby oxacilin, u močových infekcí cefalosporiny první generace nMakrolidy jsou na místě jen u alergických osob. nLinkosamidy mají význam u infekcí pohybové soustavy a opouzdřených procesů. nGlykopeptidová antibiotika (vankomycin a teikoplanin) jsou v rezervě. Používají se u kmenů rezistentních na oxacilin, takzvaných MRSA. nMeticilin rezistentní stafylokoky (MRSA) jsou epidemiologicky závažné kmeny, rezistence k ß-laktamovým ATB. n MRSA 2010 Diferenciální diagnostika nGramovo barvení odhalí všechny bakterie, které nepatří mezi grampozitivní koky nPozitivní kataláza odliší stafylokoky od streptokoků a enterokoků nStejnou službu (a ve směsi mikrobů ještě lepší) udělá kultivace na KA s 10 % NaCl nOrientačně můžeme využít i toho, že kolonie ostatních G+ koků nejsou bílé či nazláté a že mikroskopicky netvoří shluky Rozlišení stafylokoků nPlasmakoaguláza volná je pozitivní u zlatého stafylokoka, negativní u koaguláza negativních, proto se tak také označují n nClumping factor neboli vázaná plazmakoaguláza se používá stejně, ale je méně spolehlivá n nHyaluronidáza je nejen spolehlivá, ale i levná n n nMéně spolehlivé testy (nejsou důkazem) n nHemolýza: Koaguláza negativní stafylokoky mohou produkovat jen delta hemolyzin, zlaté i alfa a beta, mívají proto mnohem výraznější hemolýzu n nNazlátlé zbarevní kolonií a jejich větší průměr může také napovědět n nVětší shluky v mikroskopii jsou také typické n pro zlaté stafylokoky nV méně závažných klinických případech se spokojíme s tím, že jde o koaguláza negativního stafylokoka a netrváme na druhovém určení n nPokud je druhové určení potřeba (např. u hemokultur), lze je provést biochemicky n nV našich podmínkách se používá např. STAPHYtest 16 (Erba-Lachema) Dourčení koaguláza negativních stafylokoků Úkol 1: mikroskopie vzorku nProhlédněte si mikroskopický preparát sputa, obarvený podle Grama nPátrejte po grampozitivních kocích ve shlucích a také po leukocytech (hlavně polymorfonukleárech), které svědčí pro bakteriální zánět sputumgpkoUPR Úkol 2: barvení kultur podle Grama nObarvěte podle Grama předložené kmeny (K, L, M, N) n n(pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit, imerzní obj.) n nImerzní olej + imerzní objektiv!! S13 Úkol 3: popis kolonií na KA nPečlivě si prohlédněte předložené kmeny n nPopište všechny vlastnosti kolonií a zvlášť si všímejte těch vlastností, které odlišují stafylokoky od ostatních grampozitivních koků (výrazný pigment, konzistence) Staphylococcus aureus G:\S4[2].jpg nV úkolu 4 identifikujeme nstafylokoka tím, že roste nna KA s 10 % NaCl, nkdežto ostatní nikoli n nÚkol 5 katalázový test (kolonie vmícháme do kapky peroxidu vodíku). Pokud šumí, je to stafylokok n n Pozor! Pozitivní katalázu n má spousta bakterií, n vč. G- tyček a koků n n n n W06_staph_1884_a_sq_sm Catalase Úkol 6a - vázaná koaguláza komerční testy njsou spolehlivější než volná plasmakoaguláza n Staphaurex Úkol 6b – volná koaguláza nNejklasičtější z testů pro odlišení zlatého stafylokoka nKličkou nabrané kolonie vmícháme do králičí plasmy ve zkumavce nPokud plasma zkoaguluje (má konzistenci želé), je n koaguláza pozitivní C:\Documents and Settings\Filip\Dokumenty\Obrázky\a3.jpg Úkol 6c: Hyaluronidáza (test dekapsulace) nPrincip testu: hyaluronidáza, produkovaná zlatým stafylokokem (ne však koaguláza negativními stafylokoky) rozpouští pouzdro bakterií tvořené k. hyaluronovou (Streptococcus equii) n nZtráta pouzdra se projeví změnou vzhledu streptokoka (ztráta „hlenovitosti“) Hyaluronidáza P1020006ax Hyaluronidáza Úkol 7: rozlišení stafylokoků nSTAPHYtest 16 – jak ho odečíst nSTAPHYtest 16, zahrnuje ve skutečnosti 17 reakcí. Jako první se odečítá test VPT ve zkumavce. Červená tekutina ve zkumavce = pozitivní VPT, bezbarvá tekutina = negativní nPrvní řádek STAPHYtestu = 2. – 9. reakce nDruhý řádek STAPHYtestu = 10. – 17. reakce nVypočítejte kód a porovnejte s nKódovníkem. Kód je šestimístný. nPrvních pět číslic je z trojic testů, n šestá číslice je z dvojice C:\Documents and Settings\Filip\Dokumenty\Obrázky\a4.jpg Vyhodnocení destičkových testů ØZ takového testu dostaneme řadu výsledků – většinou ve tvaru „+“ (test pozitivní, substrát štěpen, došlo ke změně) nebo „-“ (test negativní, substrát nebyl štěpen, zbarvení zůstalo původní). ØPříklad: + - + + + - - - - - - - - + + + + ØJe několik způsobů, jak takovou řadu převést na „čitelný výsledek“: nPorovnání s tabulkou je možné jen u jednoduchých testů a jasných výsledků. nPřepočet na oktalové kódy plus vyhledání výsledku v seznamu kódů. Nejběžněji používáno nVýsledek se zadá do počítače, který „vyplivne“ vyhodnocení. Ne vždy praktické Oktalové kódy ØV praxi se každé trojici výsledků přiřadí číslice od nuly po sedmičku – viz následující obrazovka ØZaznamenají se pozitivní a negativní výsledky reakcí ØPod každou trojici se napíše 1 – 2 – 4 ØSečtou se pro každou trojici pouze číslice u „+“, nikoli u „ –“ (ty se přeškrtnou) Ø Test JAN LEN MAG TOM PET KAR FRA HAN Výsl. + – + + + – – – 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód 5 3 0 Druhý kmen (703 241 = S. epidermidis, 97,95 %, Tin=1,00) 1 2 H 3G 4 F 5 E 6 D 7 C 8 B 9 A 10 H 11 G 12 F 13 E 14 D 15 C 16 B 17 A První řádek panelu Druhý řádek panelu + S l l l l l l l l l l l l l l l l - S l l l l l l l l l l l l l l l l ? S l l l l l l l l l l l l l l l l + + + - - - + + - - + - - - + + - 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 0 3 2 4 1 Úkol 8: citlivost k antibiotikům nOdečtěte difusní diskový test – změřte zóny a porovnejte s referenčními zónami nVšiměte si, že S. aureus je relativně citlivější než koaguláza negativní stafylokoky. C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Difusní test A.JPG atbstau17 Odečtení testu citlivosti Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna Oxacilin (protistaf. penic.) OX 13 mm Cefalotin (cefalosp. 1. g.) KF 18 mm Vankomycin VA 12 mm Klindamycin (linkosamid) DA 21 mm Rifampicin RF 20 mm Gentamicin GN 15 mm