Enterobakterie P04 lKteré jsou klinicky významné G+ koky? lStafylokoky, streptokoky, enterokoky lA které klinicky významné G+ tyčinky? lNapř. listerie, koryneformní tyčinky, bacily lJak odlišíme od ostatních koků stafylokoky? lPozitivní katalázou a růstem na 10 % NaCl lJak rozlišíme streptokoky od enterokoků? lStreptokoky nerostou na SB ani na ŽE půdě. Pomoci nám může i PYR test lJak můžeme navzájem rozlišit enterokoky? lArabinosovým testem, případně EnCOCCUS lCo jsou to MRSA a VRE a proč nás zajímají? lJsou to multirezistetní epid. závažné kmeny lJak poznáme listerie? lRostou i při nízkých teplotách, vysokých koncentracích NaCl, lze využít chromog. půdy lMohou být korynebakteria běžnou flórou? lAno. Jsou jednou z nejběžnějších součástí běžné mikroflóry kůže (vedle stafylokoků) lKlinicky významné druhy rodu Bacillus? lB. anthracis ,B. cereus lV čem nám naopak rod Bacillus pomáhá? lVyužíváme je při kontrole sterilizátorů Rod Enterobacteriaceae lGramnegativní tyčinky, většinou pohyblivé (až na Shigella, Klebsiella a Y. pestis) lOxidáza negativní, (kataláza +) lBiochemicky značně aktivní (záleží na patogenitě) lKomenzálové, saprofyté či patogeny střevní i mimostřevní (obligátní i oportunní patogeny) Primární patogeny z řad enterobakterií lEnterobacteriaceae je klinicky nejdůležitější čeleď gramnegativních tyčinek lNejhorší patogeny způsobují celkové infekce: l -Yersinia pestis (mor) l - antropopatogenní serovary salmonel (serovary Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B a Paratyphi C – břišní tyfus) lZávažné jsou ale i obligátní patogeny působící zpravidla „jen“ střevní infekce. I u nich je však riziko sepse, hlavně u oslabených osob lTýká se to rodů Salmonella, Shigella a Yersinia www2.mf.uni-lj.si Podmíněně patogenní enterobakterie lEscherichia lKlebsiella lProteus lSerratia lEnterobacter lAtd. Yersinia pestis lPůvodce moru lPřenašečem je blecha morová (Xenopsylla cheopsis), zdrojem jsou krysy, potkani, popřípadě jiní hlodavci lTři formy onemocnění: ØDýmějový (bubonický) m. ØPlicní forma ØSeptická forma Ø lDalší druhy – Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis l- onemocnění zažívacího traktu Mor (Yersinia pestis) 98b black_plagueC_icon 98a bw13b 98 2 www.emedicine.com dermatology.about.com www.arrakis.es Zoopatogení salmonely lPatří mezi nejběžnější původce bakteriálních střevních nákaz (tzv. salmonelózy) lSérovary Enteritidis, Typhimurium, Infantis atd. lFekálně- orální infekce– l kontaminované potraviny lRezervoárem infekce- l různí obratlovci l vejce Antropopatogenní serovary lSérotypy Typhi, Paratyphi lSeptická onemocnění- původci břišního tyfu (popř. paratyfů) lVstupní branou infekce je trávicí trakt, zdrojem nákazy je jen člověk lPříznaky- vysoká horečka a bolest hlavy (hlavnička) obr005 33 SALMONELLA Salmonela S 34 Salmonella%20on%20XLD saenmal3 Saen Endo Endo Saen MAL MAL saenxld XLD www.medmicro.info Poznámka k salmonelám a shigelám lTo, že mezi střevními patogeny jsou rozdíly, ukazuje příklad salmonel a shigel. lSalmonely potřebují vysokou infekční dávku. Musí se tedy pomnožit v nějaké potravině. Infekce jsou téměř výhradně z potravin. lShigelám (původci tzv. bacilárních úplavic= nemoc špinavých rukou) naproti tomu stačí malá infekční dávka (asi 100 bakterií), takže se snadno přenesou špinavýma rukama, klikou od záchodu nebo kontaminovanou vodou. Escherichia coli lJe jednou z nejdůležitějších součástí střevní mikroflóry, kde je zdraví prospěšná lMůže však i škodit, a týká se to hlavně specifických kmenů: Øve střevě EPEC (enteropatogenní EC)- především u novorozenců ØETEC (enterotoxické EC)- cestovatelské průjmy ØEIEC (enteroinvazivní EC) ØSTEC (shiga-like toxigenní EC)- hemolyticko- uremický syndrom ØUPEC (uropatogenní EC)- mimo střevo lExtraintestinální (močové, septická onemocnění, infekce ran) a intestinální infekce (průjmy) 01 Ecoli 03 escherichia_coli_1 14 ecoli 14 ESCO 04 ESCO E. coli http://www.biotox.cz res2.agr.ca my.opera.com my.opera.com www2.mf.uni-lj.si Escherichie Pokud escherichie na KA hemolyzují (a to je dost často), uvede se to případně do výsledku, ale nehodnotí se to jako zvláštní diagnostický znak esly KA www.medmicro.info Rod Klebsiella lG- opouzdřené bakterie lNejvýznamnějším druhem je K. pneumoniae lVýznamné nozokomiální patogeny l - infekce močových cest l - bronchopneumonie 22 KLPN 23 KLPN opouzd Klebsiely a escherichie Kolonie klebsiel na KA jsou hlenovitější a bělejší než kolonie E. coli… klpn35 esco KA … i když zrovna tohle E. coli je taky poměrně bílé a hlenovité J www.medmicro.info Proteus prmiKA2 PrmiKA (P. mirabilis, P. vulgaris) •Původci močových infekcí •Pro protey je typické, že nerostou jen v místě inokulace, ale šíří se po povrchu agaru do stran (plazivý růst, Raussův fenomén, také fenomén příbojové vlny) www.medmicro.info 26 PRMI 27 PRMI 28 proteus1 Proteus http://www.infektionsnetz.at http://www.icbm.de http://faculty.smu.edu Přehled enterobaktérií Patogenita Příklady Systémová Y. pestis, AP** salmonely Střevní ZP* salmonely, shigely, yersinie Potenciální E. coli, Klebsiely, enterobaktery, protey, providencie, morganely, citrobaktery, serracie a jiné Téměř nulová Mnoho druhů, například Pragia fontium a Budvicia aquatica *zoopatogenení **antropopatogenní 36 CAJE Campylobacter jejuni lgramnegativní zahnutá tyčinka vyžadující speciální kultivaci lNepatří mezi enterobakterie, ale kampylobakterióza je svým průběhem a závažností srovnatelná se salmonelózou lPočet případů u nás je v posledních letech přibližně stejný jako l v případě salmonelózy www.cdc.gov 39 helicobacter%20pylori Helicobacter pylori lPeptické (tedy gastrické či duodenální) vředy jsou onemocněním, které vzniká souhrou více příčin. Takovým onemocněním říkáme obvykle multifaktoriální. lDodnes se nejen mezi praktickými lékaři, ale i mezi specialisty liší názory na podíl bakterie Helicobacter pylori na vředové onemocnění. Jisto je, že jsou i zdraví lidé s helikobakterem, stejně tak je ale jisto, že helikobakter svůj, nikoli nevýznamný, podíl na onemocnění má. http://vietsciences.free.fr Jak přežívá v extrémně nepříznivém prostředí žaludku? lUpravuje si své mikroprostředí – alkalizuje si ho tím, štěpí močovinu (silná ureázová aktivita) lMočovina se rozštěpí na kyselý oxid uhličitý, který vyprchá, a zásaditý amoniak, který zůstane a alkalizuje prostředí lŠtěpení močoviny probíhá podle reakce: l lNH2-CO-NH2 + H2O à CO2 + NH3 40 Helicobacter 43 helicobacter%20pylori 42 helicobacter www.univie.ac.at www.univie.ac.at http://www.dpc-buehlmann.at Vibrionaceae lVibria jsou G- krátké většinou zakřivené tyčinky, pohyblivé a oxidáza pozitivní lVyskytují se ve vodním prostředí teplých oblastí lVibrio cholerae způsobuje choleru, těžké průjmové onemocnění v tropech a subtropech lJiní členové rodu Vibrio mohou způsobovat také průjmy, ale i infekce ran. Tato tzv. „halofilní vibria“, preferují zvýšené koncentrace NaCl lAeromonas, druhý významný rod, také způsobuje ranné infekce, například při přípravě jídel z ryb a plodů moře. 47 vibrio_cholera_em http://www.cs.dartmouth.edu Vibrio cholerae 45 vibrio%20comma%20asiatic%20cholera 46 cholera http://bepast.org Vibrio cholerae Enterobakterie – metody lPřímé metody lMikroskopie – v praxi má malý význam, protože je jich mnoho a v mikroskopu jsou všechny stejné. Nicméně v praktiku ji použijeme lKultivace – používá se mnoho různých půd lBiochemická identifikace – velmi důležitá lAntigenní analýza – salmonely, shigely, EPEC lNepřímé metody (protilátky) lWidalova reakce u tyfu, protilátky proti yersiniím Odlišení od ostatních podezřelých (diferenciální diagnostika) lGramovo barvení odliší gramnegativní tyčinky od ostatních bakterií lEndova půda: rostou na ní z klinicky významných jen enterobaktérie, příslušníci čeledi Vibrionaceae a gramnegativní nefermentující tyčinky lNefermentující odliší to, že nefermentují glukózu (např. Hajnova půda zůstává po kultivaci celá červená, nezmění vůbec barvu) Vibrionaceae odliší pozitivní oxidáza Rozlišení enterobakterií navzájem lEndova půda podruhé: orientační rozlišení obligátních patogenů (většinou L-) a potenciálních patogenů (zpravidla L+) lSpousta dalších půd: XLD, MAL a další na salmonely, CIN na yersinie aj. lBiochemické testy: Hajnova půda, test MIU, Švejcarova plotna, ENTEROtesty aj. lAntigenní analýza zpravidla sklíčkovou aglutinací Úkol 1:Barvení kultur podle Grama lObarvěte podle Grama osm podezřelých kmenů (pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit, imerzní obj.) lJeden z kmenů nebude G– tyčinka. Pro porovnání si ještě ve druhém úkolu popíšete jeho kolonie (pro srovnání s ostatními), další úkoly už s ním ale dělat nebudete. Kult9 Úkol 2:Kultivace lPopište kolonie všech kmenů na KA a Endově půdě. Zvláště si všimněte toho, že některé z nich jsou laktóza negativní a jiné laktóza pozitivní Foto O. Z. Úkoly 3 (a, b): Gramnegativní tyčinky - rozlišení lÚkoly proveďte dle protokolu. Pamatujte: lEnterobakterie jsou oxidáza negativní (s výjimkou rodu Plesiomonas, který k nim byl nedávno přiřazen) a vždy štěpí glukózu lVibria a aeromonády také štěpí glukózu, ale jsou vždy oxidáza pozitivní lGramnegativní nefermentující baktérie (mohou to být tyčinky, ale i kokotyčinky či koky) nikdy neštěpí glukózu. Oxidázu mohou mít pozitivní i negativní Pozor, oxidáza jen demonstračně na bočním stole! Úkol 3a- Hajnova půda ØBarva spodní části půdy beze změny: bakterie nefermentuje glukózu (rozdíl tzv. G- nefermentující tyčky × enterobakterie) ØSpodní část zčerná – tvorba H2S ØPůda potrhaná, s bublinkami – tvorba plynu z glukózy ØDolní část žlutá, horní l červená – bakterie fermentuje l glukózu, ale ne laktózu ØPůda celá žlutá – fermentuje l i laktózu l newkia Úkol 4a – kultivační diagnostika enterobakterií lNa půdě XLD lsalmonely mají bledé kolonie s černým středem (trochu jako malininkaté volské oko s černým žloutkem) ljiné bakterie buď nerostou vůbec, nebo rostou málo a v koloniích jiné morfologie lNa půdě MAL to vypadá podobně, ale některé barvy či velikosti kolonií se mohou lišit od výsledku na XLD lNa půdě CIN by yersinie rostly v drobných, tmavě růžových koloniích. Pokud tam nic neroste, znamená to, že žádný z vašich kmenů není Yersinia. saenmal2 Salmonela na MAL agaru www.medmicro.info Úkol 4b – biochemické testování enterobakterií lPro biochemické testování enterobakterií používáme různé testy. V Česku používáme nejčastěji EnteroTest 16 a EnteroTest 24. My dnes použijeme první z nich lPrvní reakce je ONPG test (zkumavka s činidlem na stripu, jako VPT ve StaphyTestu a StreptoTestu). První řada panelu odpovídá 2. až 9. reakci, druhá řada je 10. až 17. reakce. Úkol 5 – antigenní analýza lUvědomte si, že antigenní analýza se nepoužívá zdaleka vždycky lPoužití je v zásadě dvojí: lU obligátních patogenů (salmonely, shigely, yersinie) pro potvrzení diagnózy a pro epidemiologické účely lU střevních izolátů E. coli v případě, že je podezření na EPEC* nebo STEC (ostatní skupiny se zpravidla takto neurčují) l*zpravidla je to u dětí do dvou let Úkol 5a: aglutinace E. coli lV současnosti detekujeme 12 serovarů EPEC lJe-li pozitivní nonavalentní sérum (I, II, III) lpokračujeme trivalentními séry (I, II a III) lje-li jedno z nich pozitivní, pokračujeme příslušnými monovalentními séry lJe-li pozitivní trivalentní sérum IV, pokračujeme s monovalentními séry patřícími do skupiny IV. lChápejte: existují stovky serovarů E. coli. Zkrátka, výsledek „E. coli, EPEC vyloučena“ znamená „je to jeden z těch zbylých asi 200“ 5b Aglutinace salmonel lPři aglutinaci kterékoli pohyblivé enterobakterie hodnotíme dva typy antigenů: tělové, tzv. O antigeny, a bičíkové, tzv. H antigeny (výjimečně i kapsulární K antigeny). lTak i každá salmonela má svou specifickou antigenní strukturu. Například salmonela serovaru Enteritidis disponuje tělovými antigeny (O) 9, 12 a bičíkovým H m. lJe-li tedy naše salmonela Salmonella Enteritidis, musí být pozitivní (aglutinace přítomna) jak při aglutinaci tělových, tak i bičíkových antigenů. Úkol 6 – testy antibiotické citlivosti lAntibiotická citlivost se zásadně neurčuje u kmenů ze stolice. (U bakteriálních průjmů většinou podání antibiotik paradoxně prodlužuje dobu vylučování patogena ze střeva; spíše než antibiotika se tedy užívá dieta a v rekonvalescenci probiotika.) lUrčuje se tedy zpravidla u kmenů z moče, proto i antibiotika zahrnují léky používané k léčbě močových infekcí (např. furantoin) Ještě k testům citlivosti lV našem případě testujme tři kmeny, které jsme určili jako Escherichia coli, Klebsiella sp. a Proteus mirabilis. Kmen salmonely netestujeme, přestože je patogenem. lPoužijeme sady G1. Je to základní sada, kromě ní existuje rozšířená sada G2 a další G3; pro močové infekce se používá zvláštní úprava G1, zvaná GNTM (močový test) Tabulka zón citlivosti – test G1 (základní) Antibiotikum Zkratka Referenční zóna Ampicilin (rozšíř. penic.) AMP 17 mm Cefalotin (CS 1 gen) KF 18 mm Doxycyklin (tetracyklin) DO 16 mm Cefuroxim (CS 2 gen) CXM 23 mm Ciprofloxacin (chinol 3G) CIP 21 mm Ko-trimoxazol (směs) SXT 16 mm Kyselina oxolinová*(ch1G) OA 19 mm *alternativně norfloxacin (NOR) Úkol 7: Diagnostika kampylobaktera lKampylobaktera si s předchozími bakteriemi nespletete. Neroste na běžných půdách, navíc jde o zahnutou tyčinku lProhlédněte si kultivační výsledky kultivace kampylobaktera a zapište popis do protokolu lProhlédněte si také oxidázový test (provede jej učitel demonstračně na bočním stole) Několik poznámek k diagnostice kampylobakterů lKampylobaktery vyžadují v zásadě čtyři věci: lSvoji černou půdu –říkáme jí běžně „půda pro kampylobaktery“ lZvýšenou teplotu na cca 42 °C. Jsou to totiž primárně ptačí patogeny a ptáci mají vyšší tělesnou teplotu lZvýšenou tenzi CO2 lProdlouženou dobu kultivace – nikoli 24, ale 48 hodin Úkol 8: Ureázový test v diagnostice helikobaktera lHelicobacter také neroste na běžných půdách. Potřebuje asi pět dní na své speciální půdě, než je viditelný růst. lVelice typické je štěpení močoviny. Na rozdíl od jiných biochemických testů v mikrobiologii zde můžeme pracovat přímo se vzorkem (žaludeční tkání) a nikoli s kmenem. V úkolu 8 uvidíte rozdíl mezi pozitivním a negativním výsledkem. 41 Helicobacter-Urease-Test Rychlý ureázový test http://de.wikipedia.org Ureázový dechový test lPacientovi se podá těžkým izotopem uhlíku (13C) nebo radioaktivním izotopem (14C) značená močovina lU zdravého močovina projde do dolní části trávicího traktu a vyloučí se stolicí lJe-li přítomen helikobakter, rozštěpí se už v žaludku a značený CO2 se objeví ve vydechovaném vzduchu. Čím více značeného CO2, tím více helikobaktera Diagnostika čeledi Vibrionaceae lProvádí se podobně jako u enterobakterií, ale jsou oxidáza pozitivní. lMikroskopicky jsou vibria pohyblivé, zahnuté tyčinky lPoužívá se také speciálních půd, například alkalická peptonová voda a TCŽS (Thioglykolát, cystein, žlučové soli) lPoužívá se obdobných biochemických testů, jako u enterobaktérií lMusí se ovšem vybrat správná matice Úkol 9: diagnostika Vibrionaceae lV mikroskopii, Vibrio je zahnutá tyčinka (podívejte se na obrázek na další obrazovce a zakreslete) lPro kultivaci používáme půdu TCŽS (pevnou půdu) a alkalickou peptonovou vodu (tekutá půda) lPro biochemickou identifikaci používáme týž Enterotest 16 jako pro enterobakterie,ale musíme použít jinou matici (v kódové knize či v počítači) lAntigenní analýzou odhalíme dva hlavní serovary Vibrio cholerae: O1 a O139. lDetailnější diagnostika uvnitř serovaru O1 (na biotypy Classic a El Tor) vyžaduje další biochemické testování 11 VIsp Vibrio sp. www2.mf.uni-lj.si