GRAMNEGATIVNÍ BAKTERIE II. lKteré jsou klinicky významné G+ koky? lStafylokoky, streptokoky, enterokoky lA které klinicky významné G+ tyčinky? lNapř. listerie, koryneformní tyčinky, bacily lA obligátně patogenní enterobakterie? lYersinie (hlavně Y. p.), shigely, salmonely (AP!) lA nějaké potenciálně patogenní? lEscherichie, klebsiely, enterobaktery, serracie, protey, providencie, morganely, citrobaktery… lJe rozdíl mezi enterokokem a enterobakterií? lEnterokok je G + kok, enterobakterie, včetně rodu Enterobacter, jsou gramnegativní tyčinky. Ovšem, všechny mají nějaký vztah ke střevu obratlovců. lKteré bakterie rostou na Endově půdě? lEnterobakterie, Vibrionaceae, G- nefermentující lJak je vzájemně rozlišíme? lNefermentující nefermentují glukózu, vibria jsou OX + lJak poznáme fermentaci glukózy? lNapříklad půda dle Hajny při kultivaci nefermentujících zůstane červená. (Existují i různé další testy.) lV čem všem je užitečná Endova půda? lJednak na ní rostou jen NĚKTERÉ lG- tyčinky, jednak rozliší L+ a L- bakterie, což je zejména při diagnostice enterobakterií velká výhoda. lKteré další půdy se používají u enterobakterií? lCIN (yersinie), XLD, MAL aj. (salmonely) lJak odlišíme EPEC? A jak S. Enteritidis? lV obou případech antigenní analýzou na skle. Rod Haemophilus lHemofily jsou krátké G- tyčinky, patří do čeledi Pasteurellaceae lV mikroskopu- od malých kokobacilů po dlouhé tyčky lNerostou na ENDU, l dokonce ani na KA, l protože nejsou schopné l získat z krvinek růstové l faktory, které potřebují. l 28 Hib Klasifikace hemofilů lHaemophilus influenzae lpouzderný typ b (Hib) lpouzderné typy a, c, d, e, f lneopouzdřené kmeny lHaemophilus parainfluenzae (mnohem běžnější a mnohem méně patogenní), Haemophilus aphrophilus a mnoho dalších druhů lHaemophilus ducreyi, původce pohlavně přenášené choroby ulcus molle lVelmi běžná je přítomnost hemofilů v krku, přičemž patogenní role je velmi pochybná. Zvlášť v případě Haemophilus parainfluenzae nepředpokládáme, že by byl patogenem. l Haemophilus influenzae lDlouho považován za původce chřipky. lVirulentní kmeny mají polysacharidové pouzdro (a až f), nejčastěji typ b (Hib). lNejzávažnější choroby jsou invazivní infekce u předškolních dětí - epiglotitida, meningitida, pneumonie a sepse. lDalší časté choroby jsou otitis media a sinutisitida. lOd r. 2001 očkování dětí http://img.ehowcdn.com/article-new/ehow/images/a06/sh/iu/haemophilus-influenzae-prognosis-800x800.j pg Růstové faktory hemofilů lHemofily vyžadují faktory z krvinek, avšak jejich potřeba konkrétních faktorů je specifická: lH. parainfluenzae vyžaduje faktor V (= NAD) lH. aphrophilus vyžaduje faktor X (= hemin) lH. influenzae vyžaduje oba faktory. l H.influenzae - růst kolem disku s faktory X+V. Klikni! H.parainfluenzae - růst kolem disku s faktorem V a s faktory X+V. Klikni! H. influenzae (vlevo), H. parainfluenzae (vpravo) www.medmicro.info Pasteurella multocida lPasteurella multocida je běžnou flórou v dýchacích cestách psovitých a kočkovitých šelem. lU člověka způsobuje zejména zhnisání ran po pokousání psem či jiným zvířetem. lMá podobný charakteristický pach, podobný hemofilovému, ale na rozdíl od něj roste na krevním agaru (nikoli však na Endově půdě) lVypadá tam jako něco mezi streptokokem a enterokokem, ale je rezistentní na vankomycin, což obvykle mikrobiologa „trkne“. Gramnegativní nefermentující bakterie lNejběžnější bakterie ze skupiny gramnegativních nefermentujících baktérií je Pseudomonas aeruginosa lMezi další patří např. rody Acinetobacter, Burkholderia nebo Stenotrophomonas lStriktně aerobní bakterie lObecně: Jsou to bakterie z vnějšího prostředí (saprofyté), často rostlinné patogeny, „bakterie-zbabělci“, které si netroufnou na zdravého člověka. Jejich terčem jsou pacienti s popáleninami, klienti ARK, JIP, transplantačních center a podobně Pseudomonas aeruginosa lRod Pseudomonas zahrnuje l desítky druhů lG- rovná tyčinka lCharakteristický zápach (jasmín) a barva (zelený pigment) lVyskytuje se v odpadní vodě, střevě obratlovců, na rostlinách a v půdě lVýznamný původce nozokomiálních nákaz, kolonizuje vlhká místa pacienta (uši, podpaží,..) lInfekce popálenin, těžké operativní výkony, katétry, maligní procesy, cystická fibróza atd. http://farm4.static.flickr.com/3007/2805482783_0d17a1be7e.jpg 04 280px-Pseudomonas 07 P 08 pseudo 05 P Výjimečný kmen pseudomonády s modrým pigmentem textbookofbacteriology.net textbookofbacteriology.net http://de.wikipedia.org www.uiowa.edu Nefermentující a cystická fibróza lCystická fibróza je těžké, vrozené onemocnění plic s poruchou produkce normálního plicního surfaktantu. To vede ke změněným charakteristikám plic, včetně mnohonásobně zvýšeného rizika infekce lNejčastějšími původci jsou: l Pseudomonas aeruginosa l Burkholderia cepacia l Staphylococcus aureus l Kmeny zpravidla získají polyresistenci. Další „nefermentující“: Pseudomonas fluorescens 31 PSFL http://www.bact.wisc.edu Burkholderia cepacia Burkholderia cepacia způsobuje hnilobu cibule (Allium cepa), je to tedy typický rostlinný patogen Nozokomiální infekce dýchacích cest 32 onion_compend 34 Burkholderia%20cepacia%20fig18 Burkholderia pseudomallei • Burkholderia pseudomallei je původcem těžkého onemocnění- melliodiózy • Příbuzná B. mallei způsobuje zoonózu zvanou malleus čili vozhřivka Nebezpečné i pro člověka 33 bpseud Stenotrophomonas maltophilia 35 STMA 36 StenoMalto-BAP-24-h Původci respiračních infekcí, ranné infekce, infekce močových cest Acinetobacter sp. 38 Acinetobacter_calcoaceticus_04-2Tag-Columbia 39 ACBA http://www.buddycom.com Z řečtiny: a-kineto- = „nepohyblivý“ Přehled metod lPřímé metody lMikroskopie – pokud ji potřebujeme pro odlišení od bakterií jiné morfologie lKultivace – nefermentující rostou na většině půd, Pasterurellaceae jsou mnohem vybíravější lBiochemická identifikace – u obou skupin; u nefermentujících je založena na reakcích aerobní respirace, vyžaduje ê teplotu a 2 dny kultivace lAntigenní analýza – zejména u hemofilů (Hib) l Nepřímé metody se téměř nepoužívají Odlišení od ostatních podezřelých (diferenciální diagnostika) lGramovo barvení odliší gramnegativní tyčinky od ostatních bakterií lEndova půda: jak již víme, rostou na ní z klinicky významných jen enterobakterie, příslušníci čeledi Vibrionaceae a gramnegativní nefermentující tyčinky lNefermentující odliší to, že nefermentují glukózu (např. Hajnova půda zůstává po kultivaci celá červená, nezmění vůbec barvu) lPasteurellaceae mimo jiné prozradí zápach Diagnostika hemofilů a pasteurel lPasteurely rostou na krevním agaru lHemofily na krevním agaru růst neumí, rostou na čokoládovém agaru lNa KA rostou v přítomnosti takové bakterie, která jim krvinku „otevře“ (satelitový fenomén). Takovou bakterií je například zlatý stafylokok lMají droboučké kolonie, proto se používá disk k odclonění ostatních bakterií (bacitracin, ale ve vyšší koncentraci než v bacitracinovém testu) Haemophilus sp. - kultivace na čokoládovém agaru . Klikni! Satelitový fenomén lJak už víme, hemofily potřebují faktory z erytrocytů, ale nejsou samy schopny je narušit. Narušení může obstarat lzahřátí agaru (čokoládový agar) lpřítomnost jiného mikroba lSatelitový fenomén představuje tu druhou možnost, jak může hemofil získat faktory z krvinek. Znamená růst hemofila pouze kolem stafylokokové čáry. l 26 satelit Detekce hemofilů Klin9 Klin9a Hemofily jsou rezistentnější než bakterie běžné flóry, takže rostou uvnitř zóny, ovšem jen kolem stafylokokové čáry (satelitový fenomén!) www.medmicro.info K diagnostice nefermentujících lPseudomonády se zpravidla poznají: lMají typickou vůni (mladé kultury) lTvoří pigmenty, nejčastěji zelené, někdy modré či rezavé. Nejlépe jsou viditelné na MH, ale trochu i na KA či Endově agaru lMají pozitivní oxidázu lOstatní nefermentující, případně sporné pseudomonády, musíme rozlišit biochemicky, například NEFERMtestem 24 Úkol 1: Barvení kultur podle Grama lObarvěte podle Grama podezřelé kmeny (pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit, imerzní obj.) lRozlišíte bakterie podle tvaru a typu buněčné stěny. Pro vzájemné G- tyčinek musíte pokračovat dál. Úkol 2: Kultivace bakterií lPodívejte se na výsledky kultivace našich bakterií na čokoládovém agaru, krevním agaru, Endově a MH půdě. Popište morfologii kolonií na krevním agaru. U bakterií, které na krevním agaru nerostou, popište kolonie na čokoládovém agaru. lHemofily potřebují faktory z erytrocytů, ale nejsou samy schopny je narušit. Musíme je tedy narušit, například zahřátím (čokoládový agar) lPasteurely na krevním agaru rostou, na Endu však nikoli lG– nefermentující naopak rostou na všech půdách Pseudomonády na MH agaru a ostatních půdách lUvědomte si, že MH agar je sám o sobě téměř bezbarvý, resp. lehce nažloutlý. lVše zelené, co vidíte na agaru, je výtvorem pseudomonády, resp. jejího pigmentu pyoverdinu lNa KA a Endu se tvorba pigmentu projevuje méně, ale projeví se také. Na těchto půdách je zato typický perleťový lesk kolonií. Úkol 3a: Satelitový fenomén lJak už víme, satelitový fenomén znamená růst hemofila pouze kolem stafylokokové čáry. lPřítomnost satelitového fenoménu je důkazem, že jde opravdu o příslušníka rodu Haemophilus lKolonie jsou mrňavé, prohlížejte je důkladně! Úkol 3b: Test růstových faktorů hemofilů HEIN HEPA HEAP Jeden disk obsahuje faktor X, druhý faktor V, třetí směs obou Úkol 3c – antigenní analýza lAntigenní analýza se u hemofilů provádí obdobným způsobem jako u jiných bakterií. Dnes jsou zpravidla k dispozici komerční soupravy, obsahující např. i latexové částice a další součásti lDříve se využívalo jevu tzv. koaglutinace se stafylokokem, kdy aglutinát byl hustší díky navázání stafylokoka na Fc konec protilátky proti hemofilovi Úkol 3c – antigenní analýza – demonstrace výsledku lZapište výsledek aglutinace hemofilů dle obrázku (jde o kmen K): 49 stafaurex předělaný na hemofily koláž s použitím: www.microbes-edu.org Úkol 3d: detekce Pasteurella typickým vzorcem citlivosti lŽádné gramnegativní bakterie nejsou citlivé na vankomycin. Vankomycin lze použít jen u grampozitivních, avšak zde je silný: všechny streptokoky a většina stafylokoků a enterokoků je citlivá. lNa druhou stranu, jen málo bakterií je citlivých na penicilin, zvlášť mezi G– tyčinkami. lKombinace citlivosti k penicilinu a rezistence k vankomycinu je poměrně specifická pro rod Pasteurella. Úkol 4: Hajnova půda pro detekci G– nefermentujících bakterií lČtyři z našich kmenů rostly na Endově agaru (vizte Úkol 2). Mohly by to být G– nefermentující, Enterobacteriaceae či Vibrionaceae. lTypické pro G– nefermentující je chybění jakékoli změny na Hajnově půdě (zůstává červená, případná nahnědlá barva nevadí, je dána přítomností pigmentů) lZapište výsledek do tabulky Úkoly 5a: Oxidázový test lProveďte oxidázový test (pro připomenutí: reakční ploška se přiloží na kolonie, pozitivita = modré zbarvení) lZ nejběžnějších G– nefermentujících tyčinek má Pseudomonas oxidázu pozitivní, Burkholderia zpravidla také; Stenotrophomonas většinou ne a Acinetobacter také nikoli. Úkol 5b: NefermTest 24 lPro přesnou biochemickou identifikaci G– nefermentujících užíváme většinou Nefermtest 24 (nebo podobný jiných výrobců). lJe to trojstrip (ne dvojstrip jako minulý týden) lKód se tu tvoří jiným způsobem: lprvní číslice je 0 (oxidáza –) nebo 1 (oxidáza +) ldalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C lsloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro případné další rozlišení NEFERMtest 24 – kmen Q (1 223 777 = Burkholderia cepacia, 100,00 %, Tin=1,00) OX H G F E D C B A + 1 + l l l l l l l l – l l l l l l l l ? l l l l l l l l – – + + + + + + 2 + l l l l l l l l – l l l l l l l l ? l l l l l l l l + + + + + + + + 4 + l l l l l l l l – l l l l l l l l ? l l l l l l l l – – – + + + + + 1 2 2 3 7 7 7 NEFERMtest 24 – kmen S (0 226 504 = Stenotrophomonas maltophilia, 100,00 %, Tin=1,00) OX H G F E D C B A – 1 + l l l l l l l l – l l l l l l l l ? l l l l l l l l – – – + – – – – 2 + l l l l l l l l – l l l l l l l l ? l l l l l l l l + + + – – – – – 4 + l l l l l l l l – l l l l l l l l ? l l l l l l l l – – + + – + – + 0 2 2 6 5 0 4 Úkol 6 – testy antibiotické citlivosti lHemofily nerostou na MH agaru lZpravidla se používá Levinthalův agar (přefiltrovaný čokoládový agar), na kterém jsou zóny lépe viditelné než na klasickém čokoládovém agaru lV naší laboratoři se používá „hemofilový agar“, což je půda blízká agaru Levinthalovu lG– nefermentující naopak rostou ochotně na nejrůznějších médiích Upozornění lHemofily tvoří velmi mrňavé kolonie. Pokud je očkujeme nahusto (jako při testování citlivosti na antibiotika), jsou ještě mrňavější. lProto je na agaru není moc vidět. Je třeba najít vhodné úhly mezi vaším okem, miskou s hemofilem a dopadajícím světlem – zprvu se zdá, že tam nic není! Tabulka zón citlivosti – HEM Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna* Ampicilin (aminopenicilin) AMP 22 mm Ko-amoxicilin (am.+inhib.) AMC 18 mm Cefuroxim (cefalosp. 2G) CXM 20 mm Tetracyklin (tetracyklin) DO 29 mm Ko-trimoxazol (směs) SXT 16 mm Azithromycin (makrolid) AZM 12 mm Tabulka zón citlivosti – neferm. Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna* Piperacilin + tazobaktam TZP 22 mm Gentamicin (aminoglykos.) CN 18 mm Imipenem (karbapenem) IPM 22 mm Ciprofloxacin (chin 3 gen) CIP 29 mm Ceftazidim (CS 3 gen) CAZ 16 mm Colistin CT 12 mm P.aeruginosa - diskový test citlivosti na antibiotika. Klikni! www.medmicro.info Zóny u hemofilů jsou často velké a splývající, což studenty mate! negoca Jsou-li zóny tak velké, že se nedají změřit, tak je neměřte a prostě rovnou napište, že kmen je na dané antibiotikum citlivý. Zeleně jsou vyznačeny hypotetické okraje zón – všimněte si, že z naprosté většiny buď splývají, nebo jsou mimo misku Úkol 7: Pseudomonas jako striktní aerob (na rozdíl od jiných) lPseudomonáda je striktně aerobní bakterie, nikoli fakultativně anaerobní jako například Escherichia coli, natož striktně anaerobní jako Bacteroides fragilis (bude probíráno v P 07). Kmen Bujón VL-bujón Výsledek N roste neroste Striktně aerobní bakterie T neroste roste Striktní anaerob M roste roste Fakultativní anaerob