DIAGNOSTIKA ANAEROBNÍCH BAKTERIÍ P07 lJaký je nejčastější původce angíny? l Streptococcus pyogenes l lKteré bakterie rostou na Endově půdě? l Enterobakterie, Vibrionaceae a nefermentující l lKteré jsou obligátně patogenní enterobakterie? l Yersinie, salmonelly, shigelly l lJak poznáte fermentaci glukózy? l Změnou barvy Hajnovy půdy l lNa jaké půdě roste gonokok? l Na čokoládovém agaru l lJaká je typická mikroskopie u neisserií a moraxel? l Gramnegativní diplokoky, intraleukocytární l lJaká je u neisserií a moraxel OXI a INAC? l Oxidáza pozitivní u obou (modrá), INAC u moraxel (zelená) l lKteré faktory vyžaduje H. influenzae? l X- hemin, V- NADP l lKteré bakterie tvoří spóry? l Bacily, klostridie l Připomeňme si, za jakých podmínek rostou jaké bakterie Prostředí Normální ¯ O2 CO2 Bez O2 Striktní aeroby ano ano ano ne* Fakultativ. anaeroby ano ano ano ano Aerotolorantní bakt. Mikroaerofilní bakt. ne ano (ano) ne* Kapnofilní bakterie ne (ano) ano ne* Striktní anaeroby ne ne ne ano** *V praxi někdy vyrostou – běžně dosahovaná anaerobióza není dokonalá **V praxi někdy nevyrostou – běžně dosahovaná anaerobióza není dokonalá. Takové bakterie (EOS – Extremely oxygen sensitive) běžně nelze kultivovat Co jsme znali doteď lV prakticích P1 až P6 jsme se seznámili se čtyřmi skupinami mikrobů, které rostou za aerobních podmínek – ať už jsou striktně aerobní jako např. pseudomonády, nebo fakultativně anaerobní jako třeba Escherichia coli. Aeroby Nyní si přidáme další čtyři skupiny lKaždá z oněch čtyř skupin má totiž svoje anaerobní „bratříčky“. Jejich vlastnosti se výrazně liší od aerobních bakterií a naopak vykazují některé společné charakteristiky. Vymyká se jen rod Clostridium, protože umí tvořit spory Aeroby a anaeroby l lPokud chce klinik, aby byl jeho vzorek prověřen na přítomnost anaerobů, mykobakterií či aktinomycet, musí to uvést na průvodce. Musí se užít speciální postupy. lU dalších původců (třeba spirochet či chlamydií) se navíc zpravidla odebírá sérum a provádí se nepřímý průkaz lTo si pamatujte hlavně pro budoucí praxi. http://de.wikipedia.org Praktická poznámka Rod Clostridium lGrampozitivní (relativně velké) tyčinky lSchopny tvořit spóry-vyklenují buňku lRostou za anaerobních podmínek v prostředí s nízkým redoxním potenciálem, některé tolerují malé množství kyslíku v prostředí lVyskytují se jako saprofyté ve střevě zvířat a člověka (hnilobné procesy), spóry v prostředí (v půdě, bahně rybníků, v řekách, v prachu i na vegetaci) lJen málo patogenních druhů. Způsobují neurotoxikózy, enterotoxikózy, a nekrotizující infekce měkkých tkání (vysoká smrtnost) Neurotoxická klostridia lClostridium tetani l ØŠtíhlé tyčinky tvořící endospóry uložené terminálně (paličky na buben) ØSoučást normální střevní mikroflóry savců, zejména koní, spóry v půdě ØPůvodce tetanu (ztrnutí šíje) tetanus-pathogen2 Tetanus • Endogenní (vagina či střevo člověka) či exogenní • Sporami infikované hlubší znečištěné či zhmožděné rány, v ráně klíčení spór • Za klinické projevy infekce je zodpovědný tetanický toxin, který blokuje inhibici motorických neuronů (brání uvolňování mediátorů této inhibice) • Projevuje se tonickými křečemi příčně pruhovaného svalstva 05 20-09b_Tetanustoxin_1 Tetanus www2.bc.cc.ca.us Žvýkací svaly (trismus) Mimické svaly Spasmy svalů trupu Postižení dýchacích svalů Svalové ruptury, zlomeniny Srdeční zástava http://nd04.jxs.cz/571/902/0888a7ccc3_76884963_o2.jpg 03 20-08_Tetanus_1 Tetanus www2.bc.cc.ca.us epistotonus lClostridium botulinum l ● ●Ve střevním ústrojí zvířat, spóry v půdě, prachu, ve vodě, kontaminanta potravin ●Původce botulismu. ●Typy: ØKojenecký botulismus- toxin produkován ve střevě dítěte, C. botulinum se zde pomnoží ØTraumatický botulismus ØAlimentární botulismus Ø l 85 Clostridium%20botulinum,%201000x,%20oil Alimentární botulismus ØZde původce vůbec nevstupuje do těla. l Jen jeho toxin (botulotoxin) vstupuje do l těla (zpravidla z nedostatečně upraveného konzervovaného masa- domácí konzervy) ØOpět účinkuje jako neurotoxin (zabraňuje uvolňování acetylcholinu do synapse a dochází k přerušení vedení vzruchu) ØVyvolává obrny- paralýzy příčně pruhovaných svalů l gastrointestinální projevy, rozostřené vidění, ztížené polykání, poruchy artikulace, zástava střevní peristaltiky, zástava močení l http://i.mimibazar.cz/h/bc/10/080423/18/j17607.jpg Botulismus 02 20-07_Botulism_1 Clostridium perfringens lJeden z původců plynaté sněti l (spolu s C. novyi, C. septicum aj.)- infekce l měkkých tkání (nekróza kůže, podkoží a svalstva) lPlynatá sněť je typické válečné onemocnění. Může se však vyskytnout i při živelných pohromách lKlostridia plynatých snětí – respektive jejich enterotoxiny – se také uplatňují jako patogeny ve střevě lExogenní a endogenní infekce Histotoxická klostridia http://www.stefajir.cz/files/GangrenaPrsty.jpg 36 CLPE 37 CLPE http://www.geocities.com Clostridium perfringens cloperf www.medmicro.info Clostridium difficile lTento mikrob se vyskytuje ve střevě celkem běžně, problém však je, když začne produkovat toxin, a především, když mu někdo odstraní konkurenci a on se přemnoží. lOdstranění konkurence způsobí nejčastěji léčba některými typy antibiotik, nejčastěji linkosamidy. Linkosamidy jsou účinné proti většině striktně anaerobních bakterií, nikoli však proti C. difficile. lLehčí průjmová onemocnění až pseudomembranózní enterokolitidy (často nozokomiální nákazy) lPoškození střevního epitelu, kumulace tekutin ve střevě, nekróza nakažených tkání lDnes se k léčbě používá nejčastěji bakteriální chemoterapeutikum metronidazol Clostridium difficile 11 Clostridium_difficile_spores 07 137_clostridium http://medecinepharmacie.univ-fcomte.fr http://www.health.qld.gov.au 91 CLDI sitemaker.umich.edu C. tetani Původce tetanu C. botulinum Producent botulotoxinu Clostridium perfringens, C. septicum aj. Klostridia plynatých snětí (+ enteropatogenita) C. difficile Enteropatogenní Je potřeba si uvědomit, že i klostridia se úplně normálně podílejí na běžné střevní mikroflóře. Problém nastává, pokud se přemnoží, dostanou tam, kam nemají, vyskytne se kmen produkující velké množství toxinu apod. Přehled klostridíí Společné charakteristiky nesporulujících anaerobů lVyskytují se jako běžná flóra: l lv tlustém střevě tvoří 99,9 % celkového objemu mikrobů, je jich tam kolem jednoho kilogramu lv ústech mohou žít díky biofilmu – jsou do něj zavzaty tak, aby neměly přímý přístup ke vzduchu, který by je ohrožoval lv pochvě nejsou přítomny u všech žen, ale uvádí se, že asi 70 % žen nějaké anaeroby v pochvě má; pokud se zde ovšem přemnoží, jde o dysmikrobii, kterou je nutno léčit lNěkteré i na kůži www.microbes-edu.org lPři zánětu obvykle neexistuje jeden původce, ale uplatňuje se směs. Někdy se používá termín „Veillonova flóra“ lSměs striktně anaerobních, ale i fakultativně anaerobních bakterií lNesporulující striktně anaerobní mikroby mají vzhledem ke svým vlastnostem velmi omezené možnosti přenosu. lVelká část infekcí je tedy endogenního původu http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTOXKv8ACrMotTIlVcJzHEcoqul6tgOUDtdXyHqw50-tMyntJqsH7OMF0yS EA Přehled nesporulujících anaerobů (u člověka nejběžnější druhy) Koky Tyčinky G+ Peptococcus Peptostreptococcus Propionibacterium*** Eubacterium G- Veillonella Fusobacterium, Leptotrichia* Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas** *se zašpičatělými konci **s rovnými konci tyčinky ***není stoprocentní anaerob 23 BAFR Bacteroides fragilis Ø Pleomorfní tvary (koky, tyčinky či vlákna) Ø Ø Běžně obývají zažívací trakt, dutinu ústní či vaginu, kde se také mohou uplatnit jako patogeny Porphyromonas gingivalis 78 Porphyromonas gingivalis Ø Hnědočerně pigmentované kolonie Ø Dutina ústní, Urogenitální trakt Prevotella melaninogenica 46 PrevMEL Ø Černý pigment Ø Onemocnění HCD (anginy, sinusitidy) Gingivostomatitis: Prevotella gingivalis 77 Porphyromonas gingivalis stomatitida www.mamagums.com 24 Fusobact Fusobacterium sp. Ø Polymorfní bakterie (vlákna) Ø Ø Pleuropulmonární infekce, chronické sinusitidy, mozkové abscesy… Ø 28 Peptostreptococcus Peptostreptococcus sp. Veillonella sp. 76 veilonella Diferenciální diagnostika– I lMikroskopie: Má větší význam než u aerobů, vzhledem k morfologické různorodosti lKultivace: Je nutno zajistit anaerobiózu pomocí anaerostatů či anaerobních boxů. U tekutých půd postačuje přelití parafinem. Používá se VL bujón, VL krevní agar a různé speciální půdy lBiochemie: kataláza a oxidáza většinou negativní, možné vzájemné rozlišení biochemicky, i analýza plynů chromatografií (jsou biochemicky aktivní) lAntigenní analýza a nepřímý průkaz se v diagnostice anaerobů příliš nepoužívají Diferenciální diagnostika– II lPokus na zvířeti se používá u tetanu a botulismu. U tetanu se myš svíjí v křeči, u botulismu jsou naopak patrné parézy. Tetanická myš http://www.microbeworld.org/index.php?option=com_jlibrary&view=article&task=download&id=245 Jak získat anaerobiózu lMechanicky – VL bujony přelijeme parafinovým olejem lFyzikálně – v anaerobním boxu se nahradí vzduch směsí anaerobních plynů, vháněných z bomby lChemicky – v anaerostatu se lz organických kyselin tvoří vodík a CO2 lv druhé fázi na palladiovém katalyzátoru reaguje vodík s kyslíkem za vzniku vody, takže se kyslík spotřebovává Přelévání VL-bujonů parafinem Anae2 www.medmicro.info, photo O. Z. Anae1 www.medmicro.info, photo O. Z. Anaerostat Anae3 Palladiový kalalyzátor (pod víčkem) nezbytný pro druhou fázi reakce Generátor anaerobiózy (sáček s chemikáliemi) nutný pro celou reakci www.medmicro.info, photo O. Z. Úkol 1a + 1b: mikroskopie vzorků a mikroskopie kultur lPodezřelé kmeny již jsou obarveny podle Grama lRozlišíte bakterie podle tvaru a typu buněčné stěny. Pro vzájemné rozlišení musíte samozřejmě pokračovat dál lAnaerobní tyčinky jsou někdy velice různotvaré – v jednom preparátu najdete útvary od vláknitých až po prakticky kokovité Úkol 2a: Anaerostat Anae3 vzduchotěsné víčko palladiový kalalyzátor (pod víčkem) konstrukce pro ukládání Petriho misek Generátor anaerobiózy (sáček s chemikáliemi) šroubovací uzávěr tlakový ventil www.medmicro.info, photo O. Z. Anae1 www.medmicro.info, photo O. Z. zdroj anaerobních plynů prostor pro vkládání misek vstupy pro ruce personálu Úkol 3: Kultivace bakterií lZjistěte, kde co roste, a to co roste, popište. lVšimněte si, že anaerobní bakterie rostou často v drobných, nepravidelných koloniích, které mají někdy výběžkaté okraje. Typický je pro ně také značný zápach. lÚkol 3a: Aerobní kultivace na krevním agaru umožňuje růst striktně aerobních a fakultativně anaerobních bakterií. Když tu tedy bakterie neroste, avšak roste na anaerobních půdách, je to striktní anaerob. l Úkoly 3b a 3c lV úkolu 3b zapište vzhled kolonií bakterií na VL (krevním) agaru lV úkolu 3c zapište vzhled růstu kmenů bakterií ve VL bujónu l lVšimněte si toho, že z našich čtyř kmenů jen dva jsou striktní anaeroby. Jeden je fakultativní anaerob a jeden je striktní aerob Úkol 4: Biochemické rozlišení lPoužívají se různé testy, v našich podmínkách především ANAEROtest 23 (Erba Lachema). Zapište výsledky jednotlivých reakcí („+“ nebo „-“) a spočítejte oktalový kód Výsledek určete podle kódové knihy POZOR – kódová kniha je rozdělená na několik částí podle morfologie anaerobních bakterií. Je třeba hledat v té správné části kódové knihy Úkol 5 – testy antibiotické citlivosti lAntibiotická citlivost se u anaerobů určuje na půdách, na kterých jsou schopny růst, tj. nikoli na MH agaru, ale zpravidla na VL krevním agaru lLékem volby u většiny anaerobů je opět klasický penicilin. Rezistentní je však rod Bacteroides (rody Prevotella a Porphyromonas, které se z něj kdysi odštěpily, jsou citlivé) Úkol 6a – průkaz tvorby lecitinázy lTvorba lecitinázy se projeví precipitací kmene na žloutkovém agaru. Protože však lecitináz je mnoho a nás zajímá pouze lecitináza druhu Clostridium perfringens, prověřujeme, zda je lecitináza inhibovatelná specifickým antitoxinem. „Negativní I“ vůbec neprodukuje lecitinázu. „Negativní II“ produkuje, ale nějakou jinou, než nás zajímá Lecitináza Úkol 6b: Průkaz toxinu pokusem na zvířeti lProhlédněte si obrázek tetanické myši. Podobně jako myš se do opistotonu dostává i pacient 10 tetanus www.biotox.cz mysh0001 bar Obrázek Petra Ondrovčíka (1959–2007) Úkol 6c: Imunochromatografický průkaz toxinu C. difficile lImunochromatografické testy jsou založeny na navazování jednotlivých komponent, podobně jako u reakcí ELISA či a imunofluorescence lNejklasičtějším příkladem je těhotenský test lTýká se především kmenů Clostridium difficile produkujících toxin. l V pozitivním případě je zpravidla viditelný proužek reakce i proužek kontroly . V negativním případě je viditelný pouze proužek kontroly. Typické citlivosti lTypické je, že mnohé anaeroby jsou rezistentní na vankomycin a/nebo amikacin. (Zároveň jsou přitom citlivé na „slabší“ antibiotika, jako je penicilin či metronidazol; na snímku) 49 Atb Úkol 7 lPodívejte se na VL s disky vankomycinu a amikacinu. Anaerobní bakterie zpravidla rostou mezi těmito dvěma disky. Vaše agary jsou na anaeroby negativní (případně může být přítomno několik málo kolonií anaerobů) lNa druhé straně můžete vidět mnoho kolonií poševních laktobacilů, mikroaerofilních bakterií často nalézaných v poševních výtěrech.