P09 Spirochety Opakování lCo obsahuje buněčná stěna mykobakterií? lMykolové kyseliny, proto je hydrofobní lJaké jsou tvarové možnosti bakterií? lKoky, kokotyčinky, tyčinky, vláknité tyčinky až vlákna, spirochety, beztvaré (mykoplasmata) lNa kterých půdách se pěstují mykobakteria? lŠula, Banič, Ogawa, Löwenstein-Jenssen lCo se musí učinit před kultivací mykobakterií? lMořit louhem, abys se odstranily jiné mikroby lKteré jsou kroky Ziehl-Neelsenova barvení? l1. Gabbet zahorka, 2. kyselý alkohol, 3. pozadí lJaké znáte bakteriální původce pohlavně přenosných chorob? lN. gonorrhoeae, H. ducreyi lKterý bakteriální původce meningitid je schopen se vyskytovat epidemicky? lN. meningitidis lKteré protilátky (Ig) mohou procházet přes placentu? lIgG lZáchyt jakých protilátek značí právě probíhající onemocnění? lIgM lJe lepší použít metodu přímou nebo nepřímou? lpokud to jde, tak vždy volit metodu přímou Spirochety ØRod Borrelia, Treponema, Leptospira ØSpirální bakterie, pohyblivé pomocí intracelulárních bičíků ØJejich buněčná stěna je blízká gramnegativní, ale podle Grama se nebarví ØMikroskopovat je lze pouze pomocí zástinu, fluorescence anebo imunofluorescence ØSpirochety se obecně prakticky nedají kultivovat 14 hechemy2 www.wadsworth.org Borrelie lPůvodci lymské boreliózy (Borrelia burgdorferi sensu lato) ØBorrelia burgdorferi sensu stricto (postižení kloubů a myokardu) ØB. afzelii (kožní příznaky) ØB. garinii (neuroborelióza) ØB. lusitaniae, B. japonica, B. bissetti lPůvodci návratných horeček l(B. reccurentis, B. duttoni, B. hermsii) Ø Ø 02a borrelia 21 Borrelia Lymeská borelióza Ø ØZoonóza ØPřenos členovci, především l klíšťaty ( u nás Ixodes ricinus) ØVakcína není k dispozici ØProtilátky nalézáme u 10 % l zdravých osob ØLék volby: peniciliny, l tetracykliny G:\lyme_cycle.gif ticks Infekce probíhá ve 3 fázích: ØČasné lokalizované st. l - erythema migrans l - nespecifické příznaky ØČasné disseminované st. l - borreliový lymfocytom l - neurologické, revmatologické či kardiální projevy ØPozdní st. l - acrodermatitis chronica atrophicans l (končetiny, trup, obličej) 220px-Erythema_migrans_-_erythematous_rash_in_Lyme_disease_-_PHIL_9875 acrodermatitis_chronica_atrophicans_herxheimer29 Průkaz ØBorrelie: •Především sérologie, popř. PCR •Sérologii se stanovují IgM (svědčí pro časnou infekci) a IgG protilátky metodou ELISA •Pozitivní nález se ověřuje Western blotem, ten je specifičtější metodou l 11 treponema Treponema pallidum ØPůvodce syfilis (poddruh T. pallidum subsp. pallidum) ØSyfilis je klasická pohlavní nemoc, přenáší se výhradně sexuálně. Jde ovšem o systémové onemocnění – v pokročilých stádiích postihuje celé tělo postiženého člověka (gummata, disekce aorty, neurolues, psychické příznaky) ØNěkteré poddruhy T. pallidum a některá jiná treponemata způsobují jiné choroby (framboesie – yaws, T. pallidum subsp. pertenue) ØNěkterá treponemata jsou i nepatogenní- na sliznicích dutiny ústní a genitálu Průběh syfilis ØČasná syfilis •Primární syfilis (ulcerace na genitálu- tvrdý vřed) •Sekundární syfilis (diseminace, nespecifické symptomy, generalizovaná vyrážka, condylomata lata) •Časná latentní syfilis (asymptomatická, relapsy sekundární fáze) ØPozdní syfilis •Latentní syfilis (cca 10-20 let) •Terciární syfilis (gummata, kardiovaskulární lues, neurosyfilis) ØVrozená syfilis 53 Syph stádia Treponemata: přímý průkaz ØPřímý průkaz se dělá zřídka ØMikroskopie: Používá se nativní preparát – zástin, mimo to lze provést fluorescenční barvení ØKultivace ani biochemická identifikace se nepoužívají ØPrůkaz antigenu lze provést přímou IMF ØPokus na zvířeti: Existuje tzv. RIT – Rabbit infectivity test (test infekčnosti na králíkovi) ØPCR diagnostika se stává čím dál důležitější 10 treponema0 Treponemata: nepřímý průkaz ØPoužívají se netreponemové testy, kde antigenem je zpravidla kardiolipin a treponemové testy, kde antigen je získán opravdu z Treponema pallidum ØDiagnostika se skládá ze screeningu a konfirmace. Konfirmuje se vše, co ve screeningu vyšlo pozitivní či aspoň hraniční, a dokonce i to, co bylo negativní, je-li důvod ØScreeningově se zpravidla použije jeden netreponemový a jeden treponemový test, konfirmace se provádí pomocí velmi spolehlivých treponemových testů ØIndikací ke konfirmaci je: ljakýkoli pozitivní či alespoň hraniční výsledek reakce RRR a/nebo TPHA lpřítomnost suspektních lézí na těle, nebo anamnéza rizikového sexuálního styku – zde i v případě negativity obou reakcí Ø Přehled nejdůležitějších nepřímých testů na lues Historický BWR – Bordet Wassermann Netr. Screeeningové RRR – Rapid Reagin Test TPHA Treponemové Konfirmační ELISA FTA-ABS (nepř. imunofluorescence) Western Blot TPHA – T. pallidum pasivní hemaglutinační test Rod Leptospira ØJemné pravidelné závity, na koncích háčkovitě ohnuté ØKomplikovaná taxonomie- dnes dělení na 17 genomospecies, původně na 2 druhy ØDříve se jednotlivé serovary leptospir považovaly za samostatné druhy, nyní se všechny patogenní považují za součást druhu Leptospira interrogans (druhý druh Leptospira biflexa je nepatogenní) ØZpůsobují zoonózy- tzv. leprospirózy, člověk se nakazí kontaktem s močí infikovaného zvířete (myšovití hlodavci, prase, skot)- koupání, konzumací kontaminované vody či potravy ØPříznaky mohou být různé, od „chřipkotyfových“ příznaků serovaru Grippotyphosa (blaťácká horečka) až po žloutenku a krvácivé stavy (Weilova choroba) serovaru Ictero-hemorragiae G:\20071025164341!Leptospira_interrogans_strain_RGA_01.png Průkaz ØLeptospiry: • Používá se zástinová l mikroskopie a kultivace l ve speciálním médiu 42 diferentes_serovares_leptospira Borrelie: úvod k úkolům 1 až 3 ØMáme pět pacientů, kteří z různých důvodů přicházejí k vyšetření na borreliózu. lPacient J: klinicky definované erythema migrans (jasný obraz, ne jen podezření) lPacient K: cítí se ospalý, v létě měl klíště; jiné potíže nejsou přítomny lPacient L: neurologové nalezli typické klinické příznaky neuroboreliózy l„Pacient“ M: zdravá osoba, ale v létě měl klíště, a cítí se ohrožen rizikem borreliózy, protože si přečetl o tomto riziku. lPacient N: je u něj podezření na neuroboreliózu, avšak není to jasné Úkol 1: ELISA – Borrelia ØPrůkaz protilátek proti Borellia garinii ØMáte k dispozici výsledky reakce ELISA ve formě hodnot absorbance ØPozitivní jsou pacienti s hodnotami vyššími nežli hodnota v kalibračním důlku (CAL). Ten se nachází v pozici A1, B1 a C1 jsou kontroly ØPrověřte výsledky pacientů J, K, L, M, N ve třídách IgG i IgM Pacienti – ELISA, jak jdou po sobě jednotlivá čísla pacientů: CAL 6 J 22 30 K+ 7 K 23 31 K- 8 L 24 32 1 9 17 25 N 2 10 18 26 34 3 11 19 27 35 4 12 20 28 36 5 13 M 29 37 CAL 6 J 22 30 K+ 7 K 23 31 K- 8 L 24 32 1 9 17 25 N 2 10 18 26 34 3 11 19 27 35 4 12 20 28 36 5 13 M 29 37 IgM IgG Úkol 2: Borrelie – konfirmace WB ØKonfirmují se pouze pacienti pozitivní v reakci ELISA, nebo indikovaní z klinických důvodů. V našem případě jsou to však všichni pacienti J, K, L, M, N (všichni byli v reakci ELISA pozitivní, s výjimkou pacienta J, který však má erythema migrans, takže je bez ohledu na negativitu ELISA indikován ke konfirmaci. ØPozitivita WB je definována následovně: Øu IgM považuje pozitivita v pruhu p 25, OspC Øu IgG považuje pozitivita v pruhu VlsE ØOdečtěte tedy výsledky IgG i IgM u našich pacientů. Úkol 3: Borrelie – PCR ØPCR je reakce přímého průkazu, je tedy průkaznější než hledání protilátek, zvlášť u čerstvé infekce ØK reakci PCR jsou indikováni z našich pacientů pouze pacienti L a N. ØZjistěte, který pacient je pozitivní ØPozitivita = svítí proužek detekované reakce ØInterní kontroly tentokrát nebyly použity ØÚplně vpravo je ladder (hmotnostní měřítko) Závěr k úkolům 1 až 3 ØJ: Nutno léčit doxycyklinem (i přesto, že je seronegativní, klinické příznaky jsou dostatečně pádným důvodem k léčbě) ØK: Zřejmě jen paměťové protilátky, nutná další diferenciální diagnostika ØL: Skutečně jde o neuroboreliózu, léčba ceftriaxonem ØM: Pacient je v pořádku (kdysi možná prodělal bezpříznakovou borreliózu, 10 % populace má pozitivní IgG) ØN: pozitivní IgM v ELISA nepotvrdil WB ani PCR, zřejmě zkřížená reakce, nutno pátrat po jiných neuroinfekcích Úkol 4: Přímý průkaz syfilis Ø4a- z etických důvodů i z důvodu pracnosti se použití RIT minimalizuje. Proto ani nemáme k dispozici obrázky výsledků tohoto testu Ø4b- mikroskopie v zástinu– prohlédněte si obrázky a obkreslete si je do protokolu (princip i vzhled Treponema pallidum) Ø4c- přímá IMF – prohlédněte si ještě další obrázek a zakreslete výsledek přímé imunofluorescence 4a New Zealand Rabbit newzealand7 Treponema 4b Zástinová mikroskopie Zástin Pouze paprsky lomící se na preparátu dopadají do oka pozorovatele. A proto oko pozorovatele vidí temné pole* se zářícím(-i) objektem(-y) *anglicky dark field, z toho anglický název zástinové mikroskopie „dark field microscopy“ FTA_ABS 4c Imunofluorescence www.medmicro.info Úkoly 5 a 6: Serologie syfilis (screening a konfirmace ) ØV úkolu 5 vybereme ze screeningových pacientů ty, které je třeba konfirmovat ØV úkolu 6 potvrdíme jejich diagnózu a učiníme konečný závěr ØPracujeme s pěticí pacientů: ØA = těhotná žena (běžný screening, není zvýšené riziko syfilis ØB = pacient s dva dny trvající lézí, která vypadá jako ulcus durum ØC = pacient se suspektní lues latens ØD = dárce krve (pouhý screening) ØE = dítě s pravděpodobnou vrozenou syfilis Úkol 5: RRR a TPHA ØU RRR je pozitivní důlek se zákalem (vypadá podobně jako pozitivní kontrola) Ø ØTPHA: Prohlédněte si panel na bočním stole. Vyhodnocení pacientů A, B, C, D, E proveďte dle obrázku na následující obrazovce TPHA Aglutinace na nosičích •Pozitivní – vzniká aglutinát, při pohledu shora chuchvalec nepravidelného tvaru •Negativní –klesají na dno a vytvářejí denzní pravidelnou kulatou tečku při pohledu shora TPHA detail +++ ++ + +/- - - - - Pozitivní kontrola (různá míra pozitivity) Pacienti (1, 2, 3) Připomenutí TPHA Negativní kontrola Technické důlky Kontrola Vlastní reakce TPHA – hodnocení: TPHA_hodnoceni Výsledky – screening RRR TPHA závěr A + 0 konfirmace B 0 0 konfirmace* C 0 +++ konfirmace D 0 0 konfirmace není nutná E + +++ konfirmace *Výsledek je sice negativní, ale konfirmační reakce budou provedeny s ohledem na klinickou situaci Úkol 6: Konfirmace syfilis Konfirmační reakce I l lVýsledky reakce FTA-ABS: l l A B C D E FTA_ABS FTA_ABS FTA_ABS FTA_ABS konfirmace se neprovádí Konfirmační reakce II ØHodnocení ELISA reakce: •Nejprve spočítejte cut off a nahraďte otazníky •c. o. = (C1 + D1)/2 •IgG: Hodnoty vyšší než ??? jsou pozitivní •IgM: Hodnoty vyšší než ??? jsou pozitivní ØHodnocení Western blottu ØZa pozitivní v IgG i v IgM považujte všechny pásky, na kterých umístění a uspořádání proužků zhruba odpovídá pozitivní kontrole Konfirmační reakce III ØHodnocení ELISA reakce: •IgG: Hodnoty vyšší než 0,366 jsou pozitivní •IgM: Hodnoty vyšší než 0,494 jsou pozitivní ØHodnocení Western blottu •Za pozitivní v IgG i v IgM považujte všechny pásky, na kterých umístění a uspořádání proužků zhruba odpovídá pozitivní kontrole Výsledky - konfirmace FTA- ABS IgM IgG Závěr ELISA WB ELISA WB A 0 0 0 0 0 Nejde o lues. Asi falešně + (např. po očkování) B 0 0 0 0 0 PCR nutné. U čerstvé inf. je možná seronegativita C + 0 0 + + Opravdu jde o lues latens, jak se přepokládalo. D konfirmace neprovedena Dárce je v pořádku E +++ + + + + Jde o kongenitální syfilis. Vyšetříme také krev matky. Úkol 7: diagnostika leptospir ØProhlédněte si obrázek a obkreslete jej leptospiry