}Mezi klinicky významné spirochety patří } borelie, treponemy, leptospiry }Jaké reakce se používají k průkazu boreliózy? } ELISA, WB, PCR }Původcem syfilis je } Treponema pallidum subsp. Pallidum }Mezi screeningové testy na průkaz syfilis patří } TPHA, RRR }Mezi konfirmační testy patří } ELISA, WB, nepřímá imunofluorescence }Bakterie patří mezi organismy } Prokaryotické } }Základem jejich buněčné stěny je } Peptidoglykan (murein) } }Jaké je složení G+ buněčné stěny? } Peptidoglykan, řetězce kys. Teichoové } }Jaké je složení G- buněčné stěny? } Tenká vrstva mureinu, nad ní vnější membrána } }Které bakterie se nebarví podle Grama? } Ty, které nemají buněčnou stěnu, nebo ji mají } hodně jinou než ostatní (acidorezistentní } bakterie, spirochéty) } } } ØMikroskopické houby= mikromycety ØHouby jsou eukaryotní organismy, na rozdíl od prokaryotních bakterií ØJejich buněčná stěna je tvořena polysacharidy, má jinou stavbu a složení než buněčná stěna bakterií. Barví se ale fialově („grampozitivně“) ØVětšinou mají pomalejší buněčný cyklus než bakterie à infekce bývají zdlouhavější ØNepůsobí na ně většina antibakteriálních látek a musíme používat zvláštní skupinu látek – antimykotika, která zase nejsou účinná při léčbě bakteriálních infekcí ØMikroskopické houby v těle působí •Mykózy-povrchové (kožní a slizniční ) a orgánové či systémové •Mykotoxikózy – toxické působení (Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria,…) •Mykoalergózy – spóry a částečky mycélia působí jako alergeny •Mycetismy – houba přítomna v těle, působí jen útlakem okolních tkání ØBlastokonidie je oválná nebo kulatá buňka, charakteristická pro kvasinky. Často vidíme pučící blastokonidie (blastospory) Ø ØHyfa je vlákno. Může být větvené, může být septované či bez přepážek. Soubor hyf se nazývá mycelium (vegetativní, ukotvující houbu v substrátu nebo generativní nesoucí rozmnožovací struktury houby) Ø ØPseudomycelium je tzv. nepravé mycelium, vzniká pučením buněk, které zůstávají spojeny, u kvasinek C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\15 Fungi_Pic.gif C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\14 pseudohyfy a hyfy.jpg gsbs.utmb.edu education.med.nyu.edu ØRozmnožování hub může být pohlavní a nepohlavní ØV současnosti se doporučuje: ◦pro sexuální rozmnožovací tělíska hub používat termín spora ◦pro asexuální, vegetativní reprodukční částice používat termín konidie ØAskospory jsou váčky obsahující vždy sudý počet pohlavních buněk. Týká se většiny klinicky významných mikromycet ØOospory vznikají splynutím velké nepohyblivé buňky samičí s malou pohyblivou buňkou samčí ØZygospory vznikají spojením dvou stejně velkých buněk opačného pohlaví ØZvláštním typem pohlavního rozmnožování je spájení hyf – přiloží se k sobě samčí a samičí vlákno a vytvořeným můstkem dojde k výměně genů ØArthrokonidie vznikají postupným oddělováním koncových částí vláken ØBlastokonidie tvoří houby, které tvoří pseudomycelia z pseudohyf – tedy nepravých hyf z protáhlých buněk oddělených zaškrcením ØChlamydokonidie jsou silnostěnné útvary kdekoli v.průběhu či na konci hyf ØMikrokonidie jsou kulovitá, oválná či hruškovitá tělíska na konci hyf ØAsexuální reprodukční tělíska v obalech či pouzdrech, například sporangiokonidie zygomycet uzavřené ve váčku – sporangiu, či makrokonidie u hub čeledi Dematiceae ØHouby se množí většinou pomaleji než bakterie, jsou však mezi nimi velké rozdíly. Rostou celkem snadno i na chudých půdách ØVětšina klinicky významných hub dobře roste i při nižších teplotách. Kultivujeme je zpravidla raději při 30 °C než při 37 °C. Druhá možnost je souběžná kultivace při 22.°C a 37 °C, vhodná u dimorfních hub ØBiochemická aktivita je pestrá hlavně u kvasinkovitých hub ØTzv. keratinofilní houby patří mezi nejběžnější původce kožních mykóz (včetně mykóz kožních adnex, tj. vlasů, chlupů a nehtů) ØMezi dermatofyty patří rody Trichophyton, Epidermophyton a Microsporum ØTypická morfologie- septovaná větvená vlákna s mikro- a makrokonidiemi, chlamydosporami ØPomalu rostoucí- delší kultivace ØPodle místa přirozeného výskytu a výběru hostitele se rozdělují na antropofilní (přenos mezi lidmi), zoofilní (ze zvířat) a geofilní (z prostředí) Ø trimen1 epifloc trirub 1 Epidermophyton floccosum 2.Trichophyton rubrum 3.Trichophyton mentagrophytes 1 3 2 http://www.asm.org/Division/c/photo/mcanis1.JPG http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/img/fungi/t/Trichophyton_tonsurans_micro1.jpg http://www.doctorfungus.org/Thefungi/img/305MIKE.JPG makrokonidie mikrokonidie chlamydospory 09 23-6_Trichophyton_foot 10 23-7_onychomycosis_EorT Onemocnění mají různé názvy podle toho, které části těla postihují (tinea manus, tinea pedis, tinea barbae a podobně). tinea C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\30 1110tinea_barbe1.jpg C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\31 tinea pedis.jpg Tinea pedis 04 23-1_tinea_capitis_Ttonsurans Tinea capitis C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\33 onychomykóza.jpg } ØTypická morfologie, pestře pigmentované } kolonie ØNapadají častěji lidi oslabené,mohou však napadnout i člověka zdravého ØČasto se aspergilóza vyskytuje jako profesní onemocnění lidí, pracujících ve vlhkých, zaprášených provozech, kde neustále poletují různé plísňové spóry ØAspergilová onemocnění jsou jedním z příkladů orgánových, případně systémových mykóz ØProdukce různých mykotoxinů (aflatoxin) C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\07 Asexual%20structures%20of%20Aspergillus%20niger.jpg C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\11 Aspergillus%20fumigatus%20nakres.jpg http://www.vscht.cz/kch/galerie/obrazky/houby/asp12eu.gif C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\12 Aspergillus%20niger%20nakres.jpg http://www.mycology.adelaide.edu.au/images/flavus.gif http://www.alamofireandwater.com/images/Aspergillus_fumigatus.jpg http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/images/plisne/kolonie/Aspergillus%20niger%20CCF%201610%20CY A%205-25.jpg C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\10 Aspergillus.jpg C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\28 aspergillus.jpg C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\24 aspergilóza rtg.jpg C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\29 ct mozku aspergilus.jpg Penicillium%20roqueforti%20nakres pen1 penits%20puhas ØPravé plísně- tvoří neseptované hyfy. Tvoří mohutný „kožíšek“, na Petriho misce mohou i nadzvedávat víčko ØInfekce jsou vzácné, ale přibývá jich např. u diabetiků ØNormálně se živí saprofyticky např. na ovoci ØJsou schopny velmi rychlého růstu např. stěnami velkých cév. Mohou způsobit i tzv. živý trombus s rychlou smrtí postiženého ØKlasické je také prorůstání z nosní dutiny do mozku, a to i během několika hodin ØNejdůležitější jsou rody Rhizopus a Mucor 50 mucor1 Rhizopus%20stolonifer%20CCF%203225%20MEA%207-25 http://www.clt.astate.edu/mhuss/rhizopus1.gif Rhizopus_arrhizus_2 http://www.tristaterestores.com/images/Types%20of%20Mold%20Images/Rhizopus.jpg ØZa nižších teplot (do 30 °C) - vláknitá forma, při teplotě kolem 37°C rostou ve formě kvasinek ØKultivace velmi dlouhá (7-30 dnů) ØJsou to původci mykóz u osob s imunodeficity ØSeverní Amerika, Afrika ØBlastomyces, Coccidioides, Histoplasma, Paracoccidioides, Sporothrix Arthroconidia_of_Coccidioides_immitis_39G0040_lores http://www.ajnr.org/content/vol20/issue3/images/large/i0195-6108-020-03-0509-f01.jpeg Ø Oproti jiným roste poměrně rychle Ø U pacientů s mírnými imunodeficity je infekce bezpříznaková či bez závažných příznaků Ø Horší je to u osob s rozvinutou chorobou AIDS, kde dochází k primárnímu postižení plic apod. ØBlastomykózy – primární plicní onemocnění nebo častější kožní formy blastomycosis 1048885-1092860-2568 http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/images/ency/fullsize/17222.jpg 8827W- }Vyskytuje se hlavně v USA, ale i v Africe Ø Morfologie: blastokonidie, pseudomycelia, chlamydokonidie Ø Pestrá biochemická aktivita Ø Oportunní patogeny- původci systémových i povrchových mykóz Ø Predispozice: • Diabetes mellitus • Širokospektrá ATB • Nesprávné stravování • Oslabená imunita Ø Infekce většinou endogenní http://www.chemistryland.com/CHM107/EarlyChemistry/PreservationChemistry/YeastCellsforWine.jpg ØKandidózy mohou být povrchové (kožní, slizniční) i systémové •Ze slizničních kandidóz se vedle vaginální mykózy vyskytuje také orální kandidóza (soor, u kojenců a oslabených osob) •Kožní kandidózy jsou také časté (například plenková dermatitida u kojenců) •Celkové infekce se vyskytují především u oslabených osob a u osob léčených kombinací širokospektrých antibiotik ØNejběžnější je Candida albicans, dále C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis a další ØU některých typické přirozené rezistence (např. C. krusei na flukonazol) C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\03 candida.jpg candida%20albicans%20gram%20stain candida200 c-albicans-on-cnaofw10 03 ústní kandidóza chronická C:\Documents and Settings\Obdržálek Vlastimil\Plocha\Houby\32 plenková dermatitida.jpg CandidiasisCrohn5 clip_image002 Yeast010 Ø U oslabených lidí může vyvolávat pneumonie, meningitidy a sepse Cryptococcus neoformans Saccharomyces cerevisiae Ø Považoval se za nepatogenní, avšak některé studie ho uvádějí např. jako původce 8 % poševních mykóz http://quiprona.files.wordpress.com/2009/10/pityriasis-versicolor.jpg Pityriasis versicolor Malassezia furfur Geotrichum http://www.fnplzen.cz/mykoatlas/kvasinky/Rhodot_ma_celk_1b.jpg Geotrichum candidum Rhodotorula ØOdběry: šupiny z kůže, ústřižky nehtů, vlasů apod.; vždy je potřeba odebrat vzorek tak, aby bylo zachyceno místo, kde je zánět aktivní, a zároveň nezachytit kontaminace; doporučuje se i povrchová desinfekce (likvidace kontaminant z povrchu kůže) Ø ØVlastní diagnostika: mikroskopická (nález vláken ve tkáni) a kultivační. Mikroskopická je důležitější – vykultivovat lze i kontaminaci, ale epitelie, kterou prorůstá hyfa (v mikroskopu) je jasným důkazem skutečné infekce. }Kromě vlastní diagnostiky mykózy je třeba vždy vypátrat (pokud to není známo), co je primární příčinou (imunodeficit, diabetes, nádor apod.) } ØDiagnostika: •pro přímý průkaz jakýkoli relevantní materiál: krev na hemokultivaci, punktáty, excize apod. •moderní metody umožňují např. přímý průkaz antigenů (manany, glukany) v krvi •nepřímý průkaz – protilátky v séru (aspergily) ØZákladem diagnostiky je kultivace (chromogenní půdy) ØBiochemické metody (využívají se vzájemné rozdíly v.metabolismu mezi kandidami) ØMikroskopicky v nativním preparátu, v Gramově či Giemsově či jiném barvení vidíme oválné buňky, často pučící, někdy tzv. pseudomycelia ØLze i testovat in vitro citlivost, ale testy jsou méně spolehlivé než u bakterií } }Gramovým barvením jasně odhalíme, co je kvasinka, a co (jaká) bakterie }Pokud by šlo jen o odlišení kvasinek, stačil by nativní preparát či jednoduché barvení }Pokud však mikrobiolog v praxi váhá např. mezi stafylokokem, kvasinkou a ještě gramnegativní nefermentující tyčinkou, použije Gramovo barvení }Violeť 30 s, lugol 30 s, alkohol 15 (až 20) s, oplach vodou, safranin 60 s, oplach }Přestože používáme pro houby speciální půdy, mnohé houby rostou i na bakteriologických půdách }Některé, hlavně kandidy, volí rafinovaně podobu téměř nerozeznatelnou od kolonií bakteriálních }Rozeznat kolonie kandid od kolonií stafylokoků je někdy obtížné. Pomoci může vůně (po chlebu či burčáku); když nepomůže nic jiného, volíme zpravidla nátěr (mikroskopii) Úkol 2b: Selektivní půda – K, L, M, N * Typická půda pro kvasinky, Sabouraudův agar, není sama o sobě selektivní a mohly by na ní růst i mnohé bakterie * Pro kultivaci na mykoorganismy ovšem používáme Sabouraudův agar s antibiotiky, který růst bakterií téměř vylučuje }CHROMOGENNÍ půdy obsahují látku, která je původně nebarevná (chromogen) }Barevnost se objeví jen při specifické reakci (odštěpení substrátu) }Půda může obsahovat více chromogenů s.navázanými substráty specifickými pro různé bakterie nebo houby }FLUOROGENNÍ půdy jsou principiálně podobné, ale s fluorescenčním barvivem }Používají se různé chromogenní půdy. Některé odliší pouze Candida albicans od ostatních, jiné rozliší vzájemně několik druhů kandid }Na půdě, kterou máme k dispozici, je C. albicans zelenavá, C. tropicalis modrá, C. glabrata hladká růžová a C. krusei drsná růžová }Pokud se některý kmen nepodaří určit chromogenní půdou, musíme použít jiný způsob, např. biochemické určení, viz Úkol 3 C. albicans C. glabrata C. tropicalis C. krusei 1-66b }Tak jako bakterie, i kvasinky (ne však vláknité houby) se dají identifikovat biochemicky }Pokuste se určit předložené kmeny pomocí přiloženého návodu a porovnáním s tabulkou }Kromě testů POX a HEX je žlutá pozitivní, modrá negativní }U testu HEX je žlutá pozitivní, bezbarvá negativní }U testu POX je hnědá pozitivní, bezbarvá negativní }„V“ = variabilní – může vyjít „+“ i „-“ }Pozor! Vyjdou tři možnosti výsledku, ALE: •Candida albicans to není, ta by byla zelená na chromagaru •Rhodotorula glutinis to také nebude, protože ta by byla pigmentovaná na Sabouraudově agaru •Je to tedy ta třetí možnost }Všimněte si, že houby nekultivujeme na MH, ale na Sabouraudově agaru }U amfotericinu B se za citlivý považuje i kmen, který má malou zónu, pokud uvnitř této zóny nejsou viditelné kolonie }U ostatních antimykotik (těch, co končí na „-konazol“) naopak musí být zóna dost velká, ale připouští se i přítomnost „čehosi“ uvnitř zóny, pokud to „cosi“ svou intenzitou nepřesahuje 20 % } intenzity růstu kolem zóny } } F1 }Diagnostika vláknitých hub se poněkud liší od diagnostiky kvasinek i co se týče mikroskopie. Ta tu má větší význam než u kvasinek } Lze pozorovat různé typy spor a konidií }Prohlížejte bez imerze, objektivem zvětšujícím 4× či 10×, popřípadě 40 ×. }Vzhled výsledků kultivace je u vláknitých hub oproti kvasinkám značně odlišný, jak na Sabouraudově agaru, tak případně i na agaru krevním }Zakreslete tři kmeny (kultury na Sabouraudově agaru ve zkumavkách) } }Některé z nich, zejména dermatofyty, rostou velmi pomalu. To kvůli nim se Sabouraudův agar nalévá do zkumavek }Biochemické rozlišení se u nich, na rozdíl od kvasinek, zpravidla neuplatňuje }Z prostředního důlku difunduje antigen (červeně) }Z pozitivního důlku se sérem číslo 2 difunduje protilátka (modře) }Z negativních důlků (séra číslo 1, 3, 4) samozřejmě žádná protilátka nedifunduje }V místě střetu antigenu s protilátkou vzniká precipitační linie (zeleně) MPA ouchterlony }Nepřímý průkaz } }Jednou z mnoha možností, jak jej provádět, je mikroprecipitace v.agaru. Precipitační linie se tvoří mezi důlkem s antigenem a důlkem s protilátkou Důlky se séry pacientů 1 – 4 Důlek s antigenem pozitivní Precipitační linie – kvůli ní je to pozitivní }Prohlédněte si videoklip a zapište si hlavní zásady odběru: } ◦nezasílat pouze stěr, nýbrž šupiny (kousek nehtu, vlasu apod.) ◦provést povrchovou desinfekci ◦povrchovou vrstvu neposílat, nýbrž vyhodit ◦u plošných ložisek odebírat z okraje (zde je houba aktivní)