CG020 Genomika Bi7201 Základy genomiky Přednáška 4 Genetika přímá Jan Hejátko Funkční genomika a proteomika rostlin, Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin, Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.muni.cz FGP_logo_color §Přímá vs. reverzní genetika § §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §metabolického profilu §exprese zajímavých genů § §identifikace mutovaného lokusu §plasmid rescue §iPCR § §Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice §poziční klonování § Osnova FGP_logo_color §Přímá vs. reverzní genetika § § Osnova FGP_logo_color „Přímě genetický“přístup 1. IDENTIFIKACE FENOTYPU 2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ 3. GENOVÁ IDENTIFIKACE -poziční klonování „Reverzně genetický“ přístup 1.IZOLACE SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO MUTANTA 2. IDENTIFIKACE FENOTYPU 3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI MEZI INZERCÍ A FENOTYPEM NÁHODNÁ MUTAGENEZE arab Přístupy „klasické“genetiky versus „reverzně genetický“ přístup ve funkční genomice EMS T-DNA (retro)transposons FGP_logo_color §Přímá vs. reverzní genetika § §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu § Osnova FGP_logo_color Inzerční mutageneze v přímé genetice §Infekce EμMyc myší retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které vznikly díky aktivaci Pim kináz (ve 40% aktivaci Pim1 a v 15% aktivaci Pim2), molekulární cíle těchto kináz byly neznámé §Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze § Mikkers et al., Nature Gen (2002) ? FGP_logo_color §Infekce EμMyc pim1 mutantů retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které obsahují v 90% inzerci v blízkosti (aktivaci) Pim2 §Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze § Mikkers et al., Nature Gen (2002) ? Inzerční mutageneze v přímé genetice FGP_logo_color §Infekce EμMyc dvojnásobných mutantů pim1, pim2 retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, u kterých lze očekávat aktivaci buď některého ze signálních partnerů Pim proteinů (Y), některého z proteinů Pim signální dráhy (X) nebo k aktivaci některé z příbuzných drah vedoucích k lymfomagenezi (Z) §Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze § Mikkers et al., Nature Gen (2002) ? Inzerční mutageneze v přímé genetice FGP_logo_color §Štěpení genomové DNA a ligace speciálních linkerů, tzv. splinkerett (zvýšení specifity amplifikace) §Izolace genomových oblastí přílehajících k místu inzerce proviru § Mikkers et al., Nature Gen (2002) Devon et al., Nucl Acid Res (1994) Inzerční mutageneze v přímé genetice FGP_logo_color §První amplifikace pomocí specifických primerů §Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru § Mikkers et al., Nature Gen (2002) Devon et al., Nucl Acid Res (1994) Inzerční mutageneze v přímé genetice FGP_logo_color §Druhá amplifikace pomocí „nested“ primerů (zvýšení specificity) §Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru § Mikkers et al., Nature Gen (2002) Devon et al., Nucl Acid Res (1994) Inzerční mutageneze v přímé genetice FGP_logo_color §Sekvenace a lokalizace oblastí přiléhajících k protoviru vyhledáváním v anotovaných databázích myšího genomu §Izolace genomových oblastí přílhajících k místu inzerce proviru § Mikkers et al., Nature Gen (2002) Devon et al., Nucl Acid Res (1994) Inzerční mutageneze v přímé genetice FGP_logo_color §Přímá vs. reverzní genetika § §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §metabolického profilu Osnova FGP_logo_color §hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů §Metabolické profilování rostlin tof-ms GC_MS_metabolomics Metabolické profilování FGP_logo_color §hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů § §identifikace (např. i komerčně) zajímavých mutantů § §Metabolické profilování rostlin tof-ms Metabolické profilování GC_MS_metabolomics_3 FGP_logo_color §hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů § §identifikace (např. i komerčně) zajímavých mutantů § §snadná a rychlá izolace genů pomocí identifikace T-DNA zasažených sekvencí § § §Metabolické profilování rostlin Metabolické profilování tc_bioanalytics tc_screening tc_bioinformatics FGP_logo_color §možnost využít i speciální techniky, např. mikrodisekce § § §Metabolické profilování rostlin Metabolické profilování vasc_bundles_prof FGP_logo_color §Přímá vs. reverzní genetika § §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §metabolického profilu §exprese zajímavých genů § Osnova FGP_logo_color §analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a identifikace mutantů se změnou exprese §Identifikace mutantů se změnou expresního profilu Expresní profil insitu gus6__1_1g1_34__30_318 immuno_2 FGP_logo_color §analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a identifikace mutantů se změnou exprese §Identifikace mutantů se změnou expresního profilu §možnost částečné automatizace (virtuální digitální mikroskopie) Expresní profil P1010006 P1010011 FGP_logo_color Image_115 01 rodic 27 obr27 41 41-1 Image_127 WT Expresní profil FGP_logo_color §Přímá vs. reverzní genetika § §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §metabolického profilu §exprese zajímavých genů § §identifikace mutovaného lokusu §plasmid rescue §iPCR § Osnova FGP_logo_color §Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis § §popis fenotypu Identifikace mutovaného lokusu FGP_logo_color Identifikace mutanta fig2 §zvlněné listy §chybějící trychomy na listech a na stonku §opožděné stárnutí §keříčkovitý fenotyp (poruchy větvení) FGP_logo_color fig §samčí sterilita, poruchy v prodlužování tyčinek (A,B) (porovnej se standardním typem C) Identifikace mutanta FGP_logo_color §Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis § §popis fenotypu §identifikace T-DNA mutované oblasti § Identifikace mutovaného lokusu FGP_logo_color 1. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k levé hranici pomocí plasmid rescue fig4 §restrikční štěpení (EcoRI) mutantní genomové DNA §religace a transformace E.coli §izolace plazmidové DNA z pozitivně selektovaných klonů §identifikovaná sekvence byla identická s genem pro NAD7 kódovaným na mtDNA Identifikace mutovaného lokusu FGP_logo_color 2. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k pravé hranici pomocí inverzní PCR (iPCR) §restrikční štěpení (EcoRI) mutantní genomové DNA §purifikace, religace a PCR pomocí T-DNA specifických primerů §klonování a sekvencování RB_flank_map §identifikovaná sekvence nebyla homologní k žádné sekvencí se známou funkcí Identifikace mutovaného lokusu FGP_logo_color §Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis § §popis fenotypu §identifikace T-DNA mutované oblasti §lokalizace T-DNA inzerce v genomu Arabidopsis § Identifikace mutovaného lokusu FGP_logo_color IGF_BAC Vyhledávání v knihovně IGF-BAC §genomová knihovna obsahující 10,752 klonů s průměrnou velikostí inzertu 100 kb §bakteriální klony uspořádané v mikrotitračních deskách § §knihovna nanesena na nylonové filtry pro hybridizaci s radioaktivně značenou sondou FGP_logo_color I. Sekvence přiléhající k levé hranici T-DNA § celkem 28 pozitivně hybridizujících klonů § 19 z nich lokalizováno na chromozomu 2 § 18 s podobností k mtDNA II. Sekvence přiléhající k pravé hranici T-DNA § celkem 6 pozitivně hybridizujích klonů § všechny lokalizovány na chromozomu 2 Mapování pomocí IGF-BAC databáze FGP_logo_color levé hranici T-DNA Sekvence přiléhající k pravé a chrom_local Lokalizace genomové T-DNA přiléhající k levé i pravé hranici T-DNA na chromozomu 2 inversion §pravděpodobně došlo k inverzi téměř celého chromozómu 2 FGP_logo_color §Přímá vs. reverzní genetika § §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §metabolického profilu §exprese zajímavých genů § §identifikace mutovaného lokusu §plasmid rescue §iPCR § §Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice §poziční klonování § Osnova FGP_logo_color §Poziční klonování §podstatou je kosegregační analýza segregující populace (většinou potomstva informativního zpětného křížení) s molekulárními markery ¨RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ¨RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) ¨AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ¨SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism) ¨polymorfizmus délky genomu (PCR produktů) amplifikovaného pomocí specifických primerů ¨polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu, detekce pomocí Southern blotu (PCR po naštěpení genomové DNA a ligaci adaptorů) ¨polymorfizmus délky náhodně (pomocí krátkých primerů, 8-10 bp) amplifikovaných úseků genomu ¨polymorfizmus délky fragmentů genomu (PCR po naštěpení genomové DNA a ligaci adaptorů) ¨CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) ¨polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu amplifikovaných pomocí PCR Identifikace mutovaného lokusu FGP_logo_color M M m m Col Ler M M m m Ler Ler m m M M Col Col m + M M Col Ler + M Col Ler m M m M + M Ler Ler + M + M Ler Ler + + M M Col Col Col Ler + M + M + + M M ♂ Ler Ler ♀ Col Col m m M M m + Col Ler Příprava mapovací populace Identifikace mutovaného lokusu FGP_logo_color Rekombinantní analýza – určení procenta rekombinace mezi mutací a molekulárním markerem r [%] = počet chomozomů Col / počet všech chromozomů x 100 marker I – ve vazbě 5 mutantů 1/10x100 = 10% marker II - žádná vazba 6 mutantů 7/12x100 = 58% •Analýza cca 2000 mutantních linií •Určení nejbližšího (ještě) segregujícího markeru •Identifikace mutace pomocí sekvenování Ler Col Ler Col FGP_logo_color Mapa DNA molekulárních markerů Mapa FGP_logo_color Markery pro jemné mapování FGP_logo_color §Přímá vs. reverzní genetika § §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §metabolického profilu §exprese zajímavých genů § §identifikace mutovaného lokusu §plasmid rescue §iPCR § §Využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice §poziční klonování § Shrnutí FGP_logo_color Diskuse