Téma 02: Primární meristémy, meristémy vegetativní a generativní Úvod Aktivita meristémů umožňuje růst (obecně označovaný jako primární růst, někdy také vegetativní), kterým jsou tvořeny nové orgány a vede ke zvýšení délky stonku a kořenů a zvětšování počtu listů. Po přeměně meristémů vegetativních na meristémy generativní vede jejich aktivita i k vývoji generativních orgánů umožňujících generativní rozmnožování. Úkolem cvičení je pozorovat vegetativní apikální a axilární stonkové meristémy na podélných parafínových řezech klíčních rostlin huseníčku a tabáku a generativní meristémy tabáku. A. Apikální meristém Arabidopsis Materiál: huseníček Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. podélný parafínový řez klíční rostlinou 2, 7 nebo 15 dnů od výsevu na agarem ztužené Murashige-Skoogovo médium Několik různých transgenních linií se systémem transkripční aktivace pOp-ipt-GUS/LhG4 odvozených od ekotypu Columbia. Aktivátorové linie huseníčku CaMV35S-LhG4 poskytl profesor Klaus Palme (Max Planck Institute, Kolín nad Rýnem, Německo). Reportérové linie huseníčku byly odvozeny pomocí vakuové infiltrace suspenze Agrobacterium tumefaciens v Laboratoři funkční genomiky a proteomiky na Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity v Brně. Aktivace transkripce konstruktu pOp-ipt-GUS byla provedena křížením aktivátorové a reportérové linie (Guo Jianchun 2002). Ihned po odběru rostlinných vzorků byla provedena jejich fixace pomocí fixáže CRAF II (chromic acid – acetic acid – formaldehyd) (Lux, Erdelská a kol. 1998), v ledničce přes noc. U starších klíčních rostlin byly ještě před fixací odstraněny dělohy (popř. i pravé listy) kvůli lepší orientaci vzorků v parafínu a větší přehlednosti podélných řezů. Etanolovou dehydratační řadou a xylenem byly objekty přeneseny do parafínu. Odparafínované řezy byly nabarveny podvojným barvením: Safranin – Fast Green (Jensen 1962) a po odvodnění byly řezy uzavřeny do syntetické pryskyřice Eukitt®. Vyhledejte na sériových řezech stonkový apikální meristém, zakreslete mediánní řez, event. proveďte jeho fotodokumentaci. Na schématu popište jednotlivé struktury řezu. B. Apikální a axilární meristém tabáku Nicotiana tabacum L. Materiál: tabák Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1 a dvě nezávislé transgenní homozygotní linie s chemicky indukovatelnou expresí ipt pomocí transkripčně aktivovatelného systému pOp::ipt/CaMV35S::LhGR, označené 303 a 307. Aktivací dexamethasonem byla v transgenních rostlinách spuštěna biosyntéza cytokininů. Rostliny byly vypěstovány výsevem semen do substrátu a kultivovány v klimaboxech Percival po dobu 5 týdnů při fotoperiodě 16h/8h, intenzitě osvětlení 120 µmol fotonů.m^-2.s^-1. Teplota kultivace 24ºC ve dne, 21ºC v noci. Po zálivce s přídavkem dexamethasonu (DEX) nebo kontrolním blankem (K) byly odebírány apikální segmenty a určité stonkové nody pro hodnocení vlivu exprese ipt na vývoj apikálních a axilárních meristémů. Doby odběru byly 1, 3 a 5 dní po zálivce. Fixace vzorků byla provedena ve směsi FAA. Butanolovou dehydratační řadou byly objekty přeneseny do parafínu. Odparafínované řezy byly nabarveny podvojným barvením alcianovou modří a jadernou červení (Beneš a Kamínek, 1973). Po odvodnění byly řezy namontovány do syntetické pryskyřice Eukitt®. Vyhledejte na preparátech se sériovými řezy stonkový apikální meristém, zakreslete mediánní řez, event. proveďte jeho fotodokumentaci. Na schématu popište jednotlivé struktury řezu. Posuďte, zda se jedná o vegetativní nebo generativní meristém. Na řezech nodálních segmentů stonků vyhledejte podélný řez axilárním meristémem a dokumentujte jej podobně jako u apikálních meristémů. Literatura Beneš, K. et Kamínek, M. (1973): The use of aluminium lake of nuclear fast red in plant material successively with alcian blue. - Biologia Plantarum, 15 (4): 294 – 297. Jensen W.A. (1962): Botanical Histochemistry. Principles and Practice. – W.H. Freeman a spol., San Francisco – London. Lux A.,Erdelská O. et al. (1998): Praktikum z anatómie a embryológie rastlín. – Skriptum Univ. Komen., Bratislava.