Téma 03:              Pozorování jaderného dělení meristematických buněk

                 Cajal – Brožkova metoda podvojného barvení roztlakových preparátů


Pozorování jaderného dělení a karyologická studia se provádějí nejčastěji na roztlakových
preparátech kořenových meristémů. K barvení buněk těchto preparátů je možno použít rozmanitá
barviva, jako acetokarmín, laktopropionový orcein, azureosinát (Giemsa) nebo bazický fuchsin.
Cajal-Brožkova metoda používá pro barvení chromatinu bazický fuchsin a pro dobarvení cytoplasmy
pikroindigokarmín. Výsledkem jsou cyklámenově fialové jaderné struktury a modrošedá cytoplazma. Pro
pozorování jednotlivých chromozomů je nutné poškození mikrotubulů achromatického vřeténka. Úkolem
cvičení je připravit roztlakové preparáty kořenových meristémů a porovnat struktury buněk po 3
hodinovém předpůsobení mitotickým jedem 8–hydroxichinolin.


Materiál: narašené cibule kuchyňské (Allium cepa L.), kořeny a kalusy z kultury in vitro, 0,2 M
8–hydroxichinolin, Carnoyova fixáž, macerační směs konc. HCl: ethanol 1:1.

Vzorky:            1. cibule – kořeny vložené do 0,2M roztoku 8–hydroxichinolinu přes noc

                        2. kalus zběhovce (Ajuga reptans L.) - vložený do 0,2M roztoku
8–hydroxichinolinu

                        3. kalus mrkve (Daucus carota L.) - vložený do 0,2M roztoku
8–hydroxichinolinu

                        4. hledík (Antirrhinum majus L.) - kořeny vložené do 0,2M roztoku
8--                                                 hydroxichinolinu přes noc

                        5. rajče (Solanum lycopersicum L.) - kořeny vložené do 0,2M roztoku
8–                                            hydroxichinolinu přes noc

                        6. cibule – kontrola – kořeny nakličované pouze ve vodě

                        7. kalus zběhovce (Ajuga reptans L.) – kontrola

                        8. kalus mrkve (Daucus carota L.) - kontrola

                        9. hledík (Antirrhinum majus L.) - kontrola

                        10. rajče (Solanum lycopersicum L.) - kontrola

Postup:

1.      Předpůsobení vzorků: vložení narašených kořenů nebo částí kalusu do 0,2M roztoku
8–hydrochichinolinu přes noc při laboratorní teplotě, kontrolní kořeny zůstávají ve vodě.

2.      Fixace: odebrané vzorky fixujeme 1 hod. v Carnoyově fixáži, složení Carnoyovy fixáže: 70%
etanol 60ml, chloroform 30ml, led. kys. octová 10ml.

3.      Oplachování v 70% etanolu:                    2 x 15 minut

4.      Macerace: ponoření kořínků na několik minut do směsi HC1 : etanol 1:1, vhodnou dobu nutno
otestovat pro každý materiál.

5.      Roztlačení kořenové špičky na podložním skle s chromovou želatinou pomocí navhčeného
celofánu.

6.      Po zaschnutí sejmutí celofánu

7.      Barvení jaderných struktur v nasyceném vodném roztoku bazického fuchsinu po dobu 15 minut.

8.      Oplach destilovanou vodou

9.      Dobarvení cytoplazmy pikroindigokarmínem po dobu 1 - 15 minut. (100 ml nasyceného roztoku
indigokarmínu + 50 ml nasyceného roztoku kyseliny pikrové).

10.  Oplach v 70% etanolu.

11.  Rychlé odvodnění: 75%, 96%, 100%, 100% etanol        po 2minutách v každé lázni

12.  Převádění do xylenu ve směsích: 100% EtOH : xylen = 2:1, 1:1, 1:2, xylen, po 2 minutách.

13.  Uzavření do syntetické pryskyřice Eukitt®


Hodnocení:

Po zatuhnutí pryskyřice hodnotíme kvalitu roztlaku, zachování struktury buněk, vybarvení
jednotlivých struktur a účinnost předpůsobení buněk mitotickým jedem.

Pokud je možné, spočítáme chromozomy u jednotlivých taxonů.

Po zaschnutí uzavíracího média provedeme fotografickou dokumentaci preparátů.


Literatura:

Hrubý K.(1933): Double Staining by the Cajal-Brožek Method. – Science 77:352 –353.