Téma 05: Životaschopnost (vitalita) pylu a metody její detekce Životaschopnost pylu je jedním z hlavních faktorů, které rozhodují o úspěšnosti oplození. Byla popsána řada metod, které testují životaschopnost pylu přímo = klíčení pylu in vitro na umělých médiích nebo nepřímo = barvením pylových zrn. Důležitými faktory klíčivosti pylu je kromě složení média teplota, pH, relativní vlhkost vzduchu, zralost pylu i hustota suspenze. Materiál: pylová zrna tabáku křídlatého (Nicotina alata Link et Otto), fuchsie (Fuchsia magellanica Lam.), kany indické (Canna indica L.), chrysantémy (Chrysanthemum hybr.), bramboříku (Cyclamen persicum MILL.), podéňka (Tradescantia pallida (Rose) D.R.Hunt, syn Setcreasea purpurea Boom). Brewbaker – Kwackovo médium pro klíčení pylových zrn (Brewbaker et Kwack 1964): 100 ml 10% sacharosa H[3]BO[3] 10 mg Ca(NO[3])[2] . 4 H[2]O 30 mg MgSO[4] . 7 H[2]O 20 mg KNO[3] 10 mg Alexandrova barvící směs pro diferenciální barvení pylu (Alexander 1969) 95% ethanol 10 ml malachitová zeleň 10 mg (1 ml 1% roztoku v 95% ethanolu)‏ destilovaná voda 50 ml glycerol 25 ml fenol 5 g chloralhydrát 5 g kyselý fuchsin 50 mg (5 ml 1% vodného roztoku)‏ oranž G 5 mg (0,5 ml 1% vodného roztoku)‏ ledová kys. octová 1 - 4 ml A. Testování klíčivosti pylu in vitro Postup: 1. Na podložní sklo naneseme kapku Brewbaker – Kwackova média, do které naprášíme pylová zrna. 2. Inkubaci provádíme ve vlhké komůrce metodou stojící nebo visící kapky. 3. Po 30 min. intervalech kontrolujeme četnost klíčících pylových zrn a délku pylových láček. Hodnocení: Vyhodnotíme rychlost klíčení pylu a četnost klíčících pylových zrn u předložených vzorků. B. Diferenciální barvení pylu Postup I.: 1. Na podložní sklo nakápneme několik kapek Alexanderovy barvící směsi. 2. Do kapky barviva naprášíme pylová zrna a přikryjeme krycím sklem. 3. Po několika minutách vyhodnotíme zbarvení pylových zrn. Poznámka: Vzhledem k tomu, že chloralhydrát a fenol jsou na seznamu nebezpečných chemických látek a vyžadují speciální bezpečnostní zacházení i likvidaci odpadu, testovali Peterson et. al. (2010) použití barvící směsi s vynecháním těchto látek a zjistili, že výsledky jsou víceméně srovnatelné s původní metodou Alexandera (Alexander 1969). Ke zlepšení penetrace barviva autoři navrhují použití Carnoyovy fixáže a zahřátí preparátu při barvení. Upravená barvící směs bez toxických látek (Peterson et al. 2010) 95% ethanol 10 ml malachitová zeleň 10 mg (1 ml 1% roztoku v 95% ethanolu)‏ destilovaná voda 50 ml glycerol 25 ml kyselý fuchsin 50 mg (5 ml 1% vodného roztoku) oranž G 5 mg (0,5 ml 1% vodného roztoku ledová kys. octová 4 ml + destilovaná voda 4,5 ml = celkový objem směsi 100 ml Postup II.: (Peterson et al. 2010): 1. Fixace poupat nebo izolovaných prašníků v Carnoyově fixační směsi alespoň 2 hod. Ve fixáži je možno skladovat materiál až 12 měsíců. 2. Umístění prašníku na podložní sklo a odsátí fixáže. 3. Přidání 2 – 4 kapek barvící směsi. 4. Zahřátí skla protažením nad plamenem kahanu téměř k varu – zlepšuje se penetrace barviva dovnitř pylových zrn. 5. Přikrytí krycím sklem a jeho jemné přitlačení zajistí srovnání pylových zrn do jedné roviny. Výsledek: Dobře vyvinutá pylová zrna jsou zbarvena červeně, abortovaná pylová zrna jsou zelená. Hodnocení: Srovnáme barvení pylu oběma metodami a zjistíme poměr vyvinutých a abortovaných pylových zrn. Literatura: Alexander M. P. (1969): Differential staining of aborted and nonaborted pollen. - Stain Technol., 44: 117-22. Brewbaker J. L. and Kwack B. H. (1964): The Calcium Ion and Substances Influencing Pollen Growth. In: "Pollen Physiology and Fertilization", Linskens, H. F. (Ed.). North Holland, Amsterdam, pp. 143–151. Peterson R., Slovin J.P., Chen Ch. (2010): A simplified method for differential staining of aborted and non-aborted pollen grains. - International J. Plant Biol. 2010; 1:e13 doi:10.4081/pb.2010.e13