Cytologie a morfologie bakterií Anthony van Leeuwenhoek Z 50 – 275 x, 17.stol Janssenovi Z 9 x, ~1595 Anthony van Leeuwenhoek První nákresy bakterií (z ústní dutiny člověka) SEM Treponema pallidum útočící na membránu savčí buňky Morfologie •Buňky •Charakteristických shluků buněk •Buněčných útvarů (spory, • konidie, sporangia, pouzdra..) •Bakteriální kolonie Většinou druhově charakteristické = identifikační znak Pozor na: fázi růstového cyklu! endospory vyklenující buňku stáří kultury pleomorfní buňky Clostridium botulinum endospora buňka char.shluk kolonie sporangium spory 2 Pleomorfní buňky rodu Corynebacterium Mycobacterium avium-intracellulare Acidorezistentní barvení buněk histologického řezu lymfatické uzliny Pleomorfní buňky M. tuberculosis Morfologie pleomorfních buněk. Další potíž: Jsou barvitelné Gramem? Haemophilus – ano Mykobakteria, mykoplazmata - nikoli Acidorezistentní buňky: Odmítají Gramovo barvení Odmítají se po nabarvení odbarvit ethanolem i kyselinou. Př: Nocardia… Bez b.s. Mykolové kys 3 Bacillus anthracis Ústní mikroflora UKÁZKA 1 Lactococcus lactis Staphylococcus aureus na pokožce Proteus Streptomyces kolonie sporangium spory Produkce ATB Struktury G- buňky Le pto spi ra 4 Morfologie buňky •PREPARÁT • - co chceme vidět? – podle toho preparát a typ mikroskopie • tvar buňky – fázový kontrast, barvený fixovaný prep. • • • • • • pohyb buňky – fázový kontrast, fluorescence • barvené struktury – pomáhají identifikaci (PHB, síra..) • typ buněčné stěny – Gramovo a acidorezistentní b. • rychlá příprava nativního preparátu barvení buněk a spor za horka a struktur Gramovo barvení světelná mikro- skopie Světelná Fázový kontrast Fluorescenční Elektronová… 5 Bacillus megaterium ccm 2007 (nativni48noma) Bacillus megaterium ccm 2007 (3-nativni24-hallo) sarcina-nativni_5 Mycobacterium tuberculosis Zeihl-Neelsonovo barvení (červeně) Je neznámý vzorek vůbec barvitelný Gramem? Není gramlabilní? S barevným filtrem Cíl mikroskopie? Typ preparátu Typ mikroskopie (typ b. stěny, průkaz struktur, růstového cyklu) Živý (nativní) preparát bez fixace– vidíme nedeformovaný tvar buňky, spory, morfologii seskupení buněk, pohyb buněk Živé a mrtvé b., pohyb Fixov. prep. – tvar a typ b. Fixov. prep. nebarvitelný Gramem 6 U jednoho bakteriálního rodu různý vzhled char. tvaru buňky! •Př: tyčky bacilů •Haemophilus Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis 10 μm H. influenzae H. ducrei •Pseudomonas P. aeruginosa P. fluorescens 7 Posuzujeme-li vzhled buňky kmene určitého bakteriálního druhu, je třeba si uvědomit: •1) Prochází sledovaný druh růstovým cyklem? •- v každém z nich má pak buňka jinou morfologii! • Př: Chlamydia, Bdellovibrio, Streptomyces, Caulobacter, myxobakterie…. •Mění se nejen vzhled buňky, •ale buňka v cyklech prochází •typickou změnou vnitřních •struktur. Buněčný cyklus Caulobacter crescentus 8 • Bacillus Bdellovibrio Myxobakterie 9 Morfologie buňky vprostřed buněčného cyklu • Životní cyklus rodu Bacillus - u některých jeho druhů i u jiných rodů navíc různá barvitelnost Gramem při různém stáří buněk – až gramlabilní při popisu preparátu nutno uvažovat stáří buněk! 10 •2) Vytváří posuzovaný druh endospory? •- v preparátu pak mohou měnit tvar buněk! „Voják umírající na tetanus“ Sir Charles Bell lukovité prohnutí zad (opistotonus) křečovitý výraz Originál je k vidění: Royal College of Surgeons of Edinburgh, Scotland. Clostridium difficile Clostridium tetani Bacillus anthracis 11 Endospory vs. exospory •G+ bakterie – endospory termorezistentní Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces •G- bakterie – exospory Méně rezistentní, odolné zejm.vůči vysychání Azotobacter, Methylosinus ALE: Př: Coxiella je G- a tvoří endospory! •Konidie: Actinobacteria Azotobacter Sporosarcina – balíčky 8 buněk fázový kontrast 12 •3) Stárnutím mění buňky tvar •4) Závislost tvaru buňky na vnějším prostředí -živiny, tlak, osmolarita… •5) pleomorfní buňky – př. rody Mycobacterium, Corynebacterium, Haemophillus, Mycoplasma • Corynebacterium Pleomorfní mykoplazmata: nejmenší bakteriální buňky (0,2 – 0,3 μm); bez buněčné stěny! Poté: Nepůsobí betalaktamy Osmoticky stabilní v host.b. 1μm velké buňky se v cyklu střídají s elementár.tělísky výběžky 13 Co je možno vyčíst z tvaru buňky •tvar buňky napovídá o metabolické aktivitě •(kokovité buňky vykazují max. metabol. aktivitu •neboť mají největší povrch ku objemu b.) •fáze růstového cyklu • 14 Morfologie charakteristických shluků buněk •typické shluky napomáhají identifikaci řetízky koků: Streptococcus řetízky bacilů: Bacillus palisády: Corynebacterium tetrády koků: Micrococcus balíčky = sarciny Sarcina hrozníčky: Staphylococcus Streptococcus Micrococcus Staphylococcus Bacillus 15 • Mikrokolonie E. coli vznikající ze tří mateřských buněk (na agaru) - charakteristický vzhled vznikajících útvarů dělících se buněk u růz. rodů…. ASM Microbe Library. J. Shapiro and C. Hsu 16 Morfologie bakt. kolonií • •potřeba zvážit typ media, ne kterém kolonie hodnotíme! • kultivace - zda vůbec kultivovatelné?? - sledování typu kolonií • •Př: sledování morfologie kolonií • – univerzální media, jiný vhled na • selektivním – zda vůbec růst či ne? barevná reakce?) • S-, R- a M-formy • sledování pohybu terasovité kolonie (Př: Proteus) • Proteus 17 Proteus – pohyb buněk Bacillus mycoides Serratia marcescens Streptomyces Streptomyces Morfologie bakteriálních kolonií I. na základních půdách Nocardia 18 E.coli na krevním agaru E.coli na MacConkey agaru Lac+ E.coli na agaru EMB (Eosin Methylene Blue Agar) Bakteriální kolonie na II. diagnost. půdách Jeden druh bakterie různá media E.coli na C.L.E.D. mediu Cysteine Lactose Electrolyte Deficient Agar 19 Mycobacterium tuberculosis obohacená a selektivní Löwenstein-Jensenova medium selektivní až na kmen! Detekce kmene E. coli O157:H7 proti jiným kmenům E. coli Bakteriální kolonie na III. selektivních půdách 20 DSCN0760 Kontaminace na misce! • 21 •Struktury a jejich konformace závisí na buněčném stadiu! • - parazité, patogeni – vstup do hostitel.b. • (př: remodelace proteinů listerií) • - změna struktur při buněčném dělení •Mikroskopie – nutno zvoli vhodný typ dle • sledované struktury • př: EM – 3 typy – mesozomy, nukleoid, cytoskelet • - dehydratace, pokovování – agregace nukleoidu artefakty Cytologie bakteriální buňky Cytoplazma – difúze nebo řízené reakce? •Přeplněná ale organizovaná • př: 72 000 ribozomů v exponenc. fázi – specif. interakce s RNA • řízeno zřejmě IR radiací, která generuje EZ vodu • (exclusion-zone water) – teorie vzniku cytoplazm.membr. •Polarizovaná • polarita buňky dána - aktinovými centry • - umístěním CM receptorů • polarita zabezpečuje pohyb b., vstup do hostitele, adhezi b. • (receptory, pilli větš. na pólech buňky) • Př: Bradyrhizobium – kořínky, Myxococcus – struktura pro PS Cytologie – 1) buněčné struktury •metody výzkumu •PŘÍKLADY: •Složky peptidoglykanu (AMK, cukry) napomáhají při taxonomických studiích • - složení PG, barvitelnost b. stěny, • serologie, fagotypizace •Výskyt typ.inkluzí – pomoc při identifikaci •Bičík – vztah mezi strukturou a mechanismem otáčení, který je různý u různých druhů!! • jejich vztah k fyziologii 25 Peptidoglykan = uniformní disacharid N-acetylglukózamin + N-acetylmuramová Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu! Acidorezistentní mykobakteria, nokardie.. nebarvitelné Gramem: N-glykolylmuramová Vztah mezi tvarem buňky a počtem disacharidových jednotek v peptidoglykanu (10 - 65) Tetrapeptid L- a D-AMK Spojení: rozdíl v pozici 3 Inter- pepti- dový můstek Micrococcaceae – až druhově charakteristická struktura můstku Streptomycety: 3 pozice unikátní L-amino DAP kyselina CHEMOTAXONOMIE: Aminkokyselinové složení tetrapeptidu a můstku!! 26 UKÁZKA_2 • rotace bičíku kolem vlastní osy – pouze u prokaryot • poháněn proton motive force (pmf) – pohyb protonů přes CM • Regulace pomocí MCP systému = proteiny 27 Cytologie a morfologie buněk v průběhu buněčného cyklu, ve fázích růstového cyklu, při dělení a smrti buňky 28 Bezpečnost a zásady práce Plášť, přezůvky, skříňky, jídlo, pití Po vstupu do laboratoře či před zahájením práce prosím o mytí rukou; test účinnosti mytí rukou Stoly – před a po práci Incidur, ethanol MO – Biohazard group 0 Mytí rukou před návštěvou toalety!!! 29 !! : případně ethanol Kahan zapnutý jen po dobu práce s ním MO – Biohazard group 0 Nemluvit při očkování mikroorganismů Misky s bakteriálními kmeny otevírat co nejméně a po práci správně zavřít Sterilní práce – žíhání kličky v plameni kahanu.. 30 Popisování misek: zespodu, svrchu – dle metody!! O náplni cvičení se informovat předem Viz Studijní materiály - příprava Nevylévat nic do odpadu – stůl: odpadní nádobky Prosíme neodnášet kultury! 31