Struktura prokaryotické buňky I. Buněčná stěna Cytoplazmatická membrána Genom Základní struktury •Cytoplazmatická membrána •Nukleoid •Ribozómy •Buněčná stěna - obvyklá • • Rozvinutý nukleoid E.coli Další struktury •Organely pohybu •Fimbrie •Plazmidy •Kapsuly, slizy •Inkluze PHB Síra Beggiatoa. Parasporální inlkuze B. thuringiensis karboxyzómy E.coli - fimbrie Streptococcus pneumoniae replikony E.coli - bičíky •Nejnovější studie: • • – nukleoid – geny pro rozdělování plazmidu (par loci), ATPázy ParA –transport (i proteinů) • - biosenzory pro detekci látek • - organizace – HLP (HU) • (folding, domény, superhelicita) • - ribozom – degradace při hladovění, 70S odolává, podjednotky 50S a 30S nikoli • - CM – beta-barrel protein – VM G- bakt. (i mitoch.) • cílové struktury hostitelských mitochondrií • - superantigeny patogenů – imunostimulační exotoxiny, • 20 SAgs u S. aureus • Cytoplazmatická membrána •Fluidní vrstva fosfolipidů (jednoduchý řetězec, esterová vazba, glyceroldiester) • Archea – etherová v. !! •Vnořené bílkoviny – mnoho proti Eucarya •Semipermeabilní – transport • G- buňky cytoplazmatická membrána + vnější membrána!! •Lipidy – složení do urč.míry podle výživy a typu prostředí •Proteiny – integrální - hydrofobní vazby, cca 70%, uvolnění rozpouštědly; periferní – elstat.síly, H-můstky – pro uvolnění není nutno narušovat membránu •Lipoproteiny – lipid do periplazmy •Glykoproteiny a glykolipidy – orientovány cukernou složkou vně membrány •Lipopolysacharidy G- - Ag •Hopanoidy – lipidy u 50% bakt. • - obdoba euk. sterolů • G+ vs. G- !! •Bílkoviny pevně vázané – enzymy (ATPáza, nukleáza, fosfatázy), transportéry, strukturální. Volné bílkoviny - fosfatázy •Inducibilní složky membrány existují, dokud existuje spouštěcí faktor syntézy. • = bílkovinné spektrum proměnlivé •Membránou obdány i některé typy inkluzí (glykogen, PHB, S, plyn. vakuoly, karboxyzomy) – 1 vrstevná, nebiologická!! •Syntéza CM - inzercí •Biogeneze membrán – proteiny Omp58 (např. protein vnější membrány BamA) •Obdoba u eukaryot: •Beta – barrelové proteiny • – VM u G- bakt. (BAM komplex v periplazmě) a v mitochondriích eukaryot (SAM v cytosolu = tím pádem cíl bakteriálních toxinů a efektorových proteinů) •Porovnání se strukturně shodnými organelami eukaryot – evoluční studie, modely patogeneze!! Fosfolipid •1) Fosfátová skupina vázaná na glycerol •2) 2 mastné kys.vázané na glycerol – 16-18C • - nevětvené, nasycené – snižují fluiditu • nenasycené – zvyšují •Hydrofobní složka - nepolární •Negativní náboj • Závislost na teplotě Funkce cytoplazmatické membrány •Bariéra •Transport – schopnost akumulace • 80% mlk – aktivní příjem •Tvorba a transformace energie – elektrontransportní systém • • Enzymy - vektorový metabolismus •Sídlo replikátoru •Místem syntéz •Permeabilita membrány •poměrně volně prostupují malé, nenabité nebo hydrofobní molekuly (O2, CO2, NH3 – ne NH4) a voda •ostatní – specifické mechanismy •Msc channels – mechanosensitivní – reagují na zvýšení turgoru buňky zvětšením velikosti póru – adaptace na osmotický stres - MscL – E. coli •MIP channel (major intrinsic protein) • Aqp – aquaporiny – voda a nenabité látky, 1 protein, u někt. bakterií, E. coli - AqpZ • Glp – transport glycerolu • Náboj CM a b.s. je odlišný, ale proměnlivý v čase Příklady adaptability bakteriální buňky - transformace strutur membrány A)biogeneze membrány • Př: Helicobacter pylori – při kolonizaci vkládání do VM nebo sekrece z VM těchto složek: LPS a OM proteiny (pro adhezi a imunostimulaci) • - změny, remodelace OM profilu!!! • neúčinnost vakcín • - cílená léčba – zasažení mechanismů transportu, které více konzervované – beta-barrely,LP,LPS a alterace permeability • - genomy minimalistů – neexprimují vše •B)nadprodukce strutur při nedostatku S •Lipoproteiny v CM mají různé role • - rezistence na ATB, adheze, sekrece, signalizace, vazba substrátu – SBP proteiny – pro transport peptidů, cukrů a kovů. •Př. hladovění na železo – stafylokoky – • železem regulované SBP proteiny nadprodukovávány, aby se buňka vyrovnala s nepříznivým prostředím •C) modifikace složek membrán patogenů či buněčných parazitů (větš.proteiny) • proč: zefektivnění přenosu a zvýšení schopnosti přežití v různých buňkách eukaryot (nebo prokaryot) •Studie na velmi úspěšném patogenu Yersinia – musí se přizpůsobit dvěma prostředím – buňkám vektoru a buňkám hostitele!!! A zároveň vykazuje úspěšný přenos •Př: v čeledi enterobakterií proteiny Ail, OmpX, PagC, Lom. • konkrétně Ail – (fce: inhibice komplementu a zánětu, adheze bakt.buňky na host.tkáň) – shift ve stavbě homologů způsobil proměnu z enterobakterie na systémového patogena!! Mezozomy •Deriváty membrány •Vážou chromozomy, duplikují se dělením •Deriváty CM, viditelné po lehkém obarvení CM •Počet závisí na metabolické aktivitě •Sídla enzymů membrány – DNA polymeráza na 1-4 místech VM Chromatofory fototrofů •Deriváty membrány •Chromatofory purpurových sirných bakterií •Cylindrické vezikuly zelených bakterií a vícevrstevné tylakoidy Cyanobacteria (sinic) Buněčná stěna •Peptidoglykan •Glykan – cukerná složka, NAG, NAM • N-acetylglukózamin+N-acetylmuramová k., • ß-1,4-glykosidická vazba – kostra = opakování aminocukrů •Peptid – tetrapeptid – L-ala – D-glu – R – D-ala • •R = DAP – pouze v b.s., taxonomický znak u aktinobakterií, LL DAP, meso DAP •G+ :R = lysin větš., tetrapeptidy spojeny pentapeptidem •G- :vždy DAP a meso-DAP, tetrapeptidy spojeny přímo D-ala na DAP Peptidoglykan = uniformní disacharid N-acetylglukózamin + N-acetylmuramová Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu! Acidorezistentní mykobakteria, nokardie.. nebarvitelné Gramem: N-glykolylmuramová Vztah mezi tvarem buňky a počtem disacharidových jednotek v peptidoglykanu (10 - 65) Tetrapeptid L- a D-AMK Spojení: rozdíl v pozici 3 Inter- pepti- dový můstek u G+ Micrococcaceae – až druhově charakteristická struktura můstku Streptomycety: 3 pozice unikátní L-amino DAP kyselina CHEMOTAXONOMIE: Aminkokyselinové složení tetrapeptidu a můstku!! Peptidoglykan G- •G+ G+ : tetrapeptidy spojeny pentapeptidem G- :tetrapeptidy spojeny přímo D-ala na DAP •Lysozym – štěpí vazbu mezi aminocukry; • = působí na hotovou stěnu •Penicilin – brání spojení tetrapeptidů • = působí při syntéze stěny •Bacitracin - cyklický polypeptid blokující defosforylaci fosfolipidu, potřebného pro transportní funkci během výstavby buněčné stěny. Polymer Spojení tetrapeptidů různé u G+ a G- Taxonomický význam •Barvení buněčné stěny •Chemotaxonomie složek stěny a membrány •FAME profil mastných kyselin – char.pro jednotlivé rody, druhy až kmeny, závislý na kultivaci • - celobuněčný, ale hlavně z CM • Archea – extrémní podmínky: • •PEPTIDOGLYKAN • 5 typů buněčné stěny Bacteria vs. Archaea !! strukturní shody ale rozdílné chemické složení •---- rozdílná citlivost na ATB • tRNA archeí podobná eukaryotické Archaean diagram ANd9GcRuprOJEiygmfTZyFqKC6hn9hOwnM0HzxztRoALuk6LqeBBpKIZSw phospholipid diagram Cytoplazmatická membrána Sulfolipidy, glykolipidy, nepolární isoprenoidní lipidy, fosfolipidy, větvené lipidy, mnoho proteinů v membráně FOSFOLIPID: (1) chiralita glycerolu (L-glycerol; dáno enzymy) (2) etherové vazby - glyceroldiether, tetraether = jiné chem.vlastnosti fosfolipidů (3) řetízky isoprenoidů namísto MK (4) větvení isoprenoidu Nepřítomnost sterolů • • •Často jednovrstevná – diglycerol tetraether • glycerolové jednotky na obou koncích MK = tvoří 1vrstvu •Lepší přizpůsobení extrémům •– monolayer rezistentnější k narušení teplem •Sulfolobus – 90°C a pH 2, větvené uhlovodíky a 2x tak dlouhé než u bakterií • •Mykoplazmata • - bez b.s. • •Protoplasty •Sféroplasty •netvoří peptidoglykan •V.S., D. S. •M. hominis vyvolává lidskou primární atypickou pneumonii (PAP) a je označované jako PPLO (pleuropneumonia-like organism) •Studium genomu http://www.zdravotnickenoviny.cz/scripts/detail.php?id=304611 nejmenší známý mikroorganismus schopný samostatného života pg Během evoluce se objevily mnohonásobné redukce velikosti genomu a byl pozměněn i genetický kód. Celkové tempo evoluce je necharakteristicky vysoké. Jediným předpokládaným významem redukce velikosti genomu je evoluce Mollicutes na striktní parazity, jejichž velká část metabolické mašinérie zakrněla. Acidoresistentní bakterie nebarvitelné Gramem •Buněčná stěna: •Obsah lipidických látek – hl.mykolové kyseliny (3-OH mastné kyseliny s dlouhým C řetězcem na pozici 2). Délka řetězce specifická. •Př: mykobakterie, nokardioformní aktinomycety, korynebakterie •Mykolyl-arabinogalaktan tvoří lipidickou bariéru – brání penetraci kyseliny •Odbarvování 1)kyselým alkoholem (striktní) • 2)slabou kyselinou (2.stupeň) Mycobacterium acidorezistence 1.stupně – po 1.obarvení bazickým barvivem (fuchsin) se již neodbarví kyselinou ani alkoholem •Mykolové kyseliny s 60-90C • - rezistence vůči pronikání barviv, ATB, vysychání, fagocytóze •Barvení za horka – lipidy nepropouští barvivo, a nepravidelně (nerovnoměrně) •Gramovo barvení – vůbec nebo špatně •Peptidoglykan: • - amidické skupiny na glutamátu i na meso-DAP, opakování peptidických podjednotek • - přítomnost 2 typů mezopeptidového spojení • (D-ala + meso-DAP, meso-DAP + DAP – 70%, pouze zde) • - N-glykolylmuramová kyselina místo N-acetylmuramové • • Mycobacterium •Hydrofobní buněčná stěna • - problém s transportem Fe (siderofory – chelatizují Fe) • - exocheliny – extracelulární • - mykobaktiny – uvnitř buňky •Pomalý růst – 3-9 týdnů • - zpomalení transportu přes hydrofobní povrch • - RNA-pol – nižší reakční rychlost,(pomalejší syntéza RNA) • - nízký poměr RNA/DNA – pomalejší syntéza proteinů • Mycobacterium •Metabolismus • Využívání různých typů uhlovodíků •(halogenované, degradace polutantů) •Růst na CO2 a H20 •Produkce karotenoidních pigmentů • - bez nich – TBC • - fotochromogenní – jen na světle (M. kansaii) • - skotochromogenní – M. gordonae (pigment i ve tmě) Uspořádání buněčných struktur v cytoplazmě •Na prostorové orientaci má podíl: • - účast enzymů ATPáz ParA (transport NK, proteinů) • - gradient membrány •Mobilizace struktur – řízeno IR zářením, které generuje exclusion zone (EZ) water •Specifické interakce molekul přítomných v obrovském množství za maximální hustoty cytoplazmy •Polarizace struktur cytoplazmy – dáno actinovými centry a organizací cytoplazm.membrány • Buněčné struktury •Trvalé •Pozměněné např.při vstupu do hostitelské b. • (remodelace proteinů intracelulárních patogenů) •Remodelace struktur při buněčném dělení • •Složení a 4D závisí na buněčném stadiu •Metody studia: •X-ray crystalography •TEM •Publikace 70 léta – řada struktur jako artefakty!! Genetická informace • •Velikost genomu: • „specialisté“: ~1,5 MBp, „generalisté“- ~4 – 8 MBp •Složky genomu: • Chromozom – 1-2 • Plazmidy – (integrované=epizomy) – 0-n; F, R, Ti, Col • Mobilní elementy: transpozony, inzerční sekvence • Bakteriofágy • •Způsoby přenosu – transformace, konjugace, transdukce Replikony – obojí kružnicové i lineární Bakteriální chromozóm •Zpravidla cirkulární DNA • (lineární – Borrelia, Streptomyces, Coxiella; Paracoccus denitr. • 2 oddělené chromozomy – Rhodobacter sphaeroides •E. coli – 4,7 . 106 nukleotidů •Průměrná hmotnost: 5 . 10 – 15 g DNA •0.58 Mbp Mycoplasma genitalium •4.4 Mbp Mycobacterium tuberculosis, E. coli •Vazba na CM – mezozomy, dělení •Replikace předchází dělení buňky •Vazba cca 105 mlk histon-like proteins - flexibilta 3mlk DNA, 2 jsou lineární •G+C obsah (melting point): • 28% (Clostridium) - 72% (Sarcina). •Frekvence mutace •NCBI – databáze sekvenovaných genomů •Architektonická organizace: • - kondenzace do kompaktní struktury, HLP proteiny asociované s DNA, napomáhají skládání NK. Vysoce konzervované u eubakterií (HU protein) • - topologická organizace do domén, specificá superhelicita domén • Využití bakteriálních nukleoidů •Modelové MO •Integrace biosenzorů do NK – stabilita, vysoké množství biosenzorů (mnoho buněk v buněčné mase = citlivost) Plazmidy •Doplňková genet. informace: • F-plazmidy (fertilitní) • Rezistence, - ATB, těžké kovy, UV • Metabolické dráhy (bioremediace) • Přenos konjugací, transformací • Bakteriociny (ne– i konjugativní) • Kódování faktorů virulence: adheziny, toxiny • hemolyziny, enterotoxiny • Ti –tumorindukující plazmidy • Kryptické, fazmidy, kosmidy •5-10% informace genomu •Genetické inženýrství - vektory • • •Rozdělování plazmidů: • - geny pro tento děj na plazmidech i na nukleoidu • - ATPáza ParA – přesun plazmidů Ribozómy •Proteosyntéza •2 podjednotky – • Mg + energie (ATP, GTP) – podmínka funkce •rRNA + proteiny •70S = 30S + 50S (Svedbergovy jednotky) •(sedimentaci vedle hmotnosti ovlivňuje i konformace) • 30S………..1540 nukleotidů, 21 proteinů • 50S………..2900 nukleotidů, 34 proteinů •Selektivní působení ATB pouze na bakteriální ribozomy – jiné cílové místo •Archea – odlišnosti, větší resistence (Kan, Ery) • (Proteosyntéza je inhibována anisomycinem ) • RNA – Bacteria vs. Archaea !! Kvantitativní a kvalitativní analýzy ribozomů •V reálném čase až 72 000 ribozomů •Studie s antibiotiky (zábrana sloučení podjednotek 30S a 50S, zábrana vazby tRNA - aminoglykosidy) •Iniciace degradace ribozomů při hladovění buňky – volné podjednotky 30 a 50S jsou náchylnější pro degradaci než celistvý 70S • •focosi.immunesig.org/physiobacteria.html •www.bact.wisc.edu/ •http://www.ucmp.berkeley.edu/archaea/archaeamm.html •H Heller, M Schaefer, & K Schulten, Molecular dynamics simulation of a bilayer of 200 lipids in the gel and in the liquid-crystal phases, J. Phys. Chem. 97:8343-60, 1993 •