Růstové cykly bakterií Tvorba spory Buněčný cyklus Caulobacter crescentus • • Komplexní růstový cyklus myxobakterií Agregace buněk Fruktifikační orgány Plodnice rodu Myxococcus Jednoduché růstové cykly •Důvodem je adaptace či příprava (u sporulace) na změny podmínek životního prostředí •U parazitů: přechod z prostředí těla vyšších organismů ven •Jaké buněčné formy v doménách Bacteria a Archaea rozeznáváme? •rostoucí a dělící se vegetativní formy buněk •struktury dovolující přežití nepříznivých podmínek (cysty odolné proti dehydrataci, ne však proti horku - Azotobacter, Myxococcus, Sporocytophaga, kdy je celá buňka obklopena protektivní vrstvou nad buněčnou stěnou) •rody Metylosinus and Rhodomicrobium vytváří termostabilní exospory. •Konidie - termosenzitivní asexuální reprodukční struktury produkované různými rody aktinomycet •endospory - odolná klidová nereproduktivní stadia s několika vyjímečnými charakteristikami Vegetativní a klidové stadium Tvorba spor •převážně G+ bakterie •– termorezistentní endospory •Bacillus (aerobní tyčky), Clostridum, Thermoactinomyces a Desulfotomaculum (anaerobní tyčky), Sporosarcina (aerobní koky), Sporolactobacillus, Oscillospira, Thermoactinomyces •Výjimečně i G– bakterie (Coxiella burnetii, původce Q-horečky). • •G- bakterie – exospory •Méně rezistentní, odolné zejm.vůči •vysychání Azotobacter, •Methylosinus • sporacereus Fázový kontrast Bacillus megaterium – zelené spory obarvené varem v malachitové zeleni c Azotobacter – cysty Clostridium difficile C. perfringens •Azotobacter – pouzdra, cysty sureae5 Sporosarcina ureae – kulaté spory uvnitř čtveřice (balíčku) buněk •Oproti doméně Eucarya v buňce přítomna pouze jedna endospora •Peptidoglykan v kortexu spory je zcela jiného charakteru než peptidoglykan samotné buňky vytvářející sporu • •Stabilizace makromolekul ve spoře: přítomností specifických bílkovin, dále ztrátou vody a její náhradou vápníkem (pouze zde přítomna v přírodě unikátní kyselina dipikolinová) • •Vysoká odolnost napomáhá přečkat podmínky nevhodné pro život i po tisíce let (?); jsou prostředkem šíření bakterií i na značné vzdálenosti a v různém prostředí. • •Tvorba endospory však není odpovědí na prostředí, ale přípravou na nepříznivé podmínky. Endospora, sporulace … s několika vyjímečnými charakteristikami… minimální obsah vody ----- minimální metabolismus •Odolné k působení UV a γ záření, vysoušení, lysozymu, teplotním změnám, nedostatku živin a působení mnoha dezinfekčních prostředků. V ethanolu mohou přežívat několik měsíců. • •Sporicidní látky: • ethylenoxid, β-propionlakton, koncentrované louhy a kyseliny, formaldehyd při prodloužené expozici, kyselina peroctová – Persteril, jodové preparáty, chloramin. • • •Jednou odstartovaný proces sporulace již nejde zastavit – regulace v uzlových bodech •Asporulační medium – glukóza • Pozorování endospor •Pozorovat neobarvené endospory můžeme fázovým (zářící spory) a Nomarského kontrastem (plastický povrch buňky); •Jednoduchým barvením nezvýrazníme spory samotné, jen vyklenutí buňky (způsobené jejich přítomností). • Přímo obarvit endosporu od stadia vzniku kortexu je možné pouze za horka (prospora je pro barvivo ještě propustná!). C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\Milada\protokol4spory\b.cereus.no marsky.spory8.jpg C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\Milada\protokol4spory\spora.cereu s.fazovy.jpg Fázový k. Nomarského k. vysoce světlolomné útvary nepřijímající Gramovo barvivo •Strukturální barvení endospor •Diagnostické Gramovo barvení určí G+ a G- typ buněčné stěny; souběžné strukt. barvení spor u suspektních sporulujících druhů zvýrazní: •Tvar, velikost a umístění spory v buňce je dalším charakteristickým znakem napomáhajícím identifikaci. •Př: vždy oválné spory B. cereus, B. anthracis, Clostridium botulinum, kulaté spory Clostridium tetani či B. sphaericus, cylindrické či elipsoidní spory dalších druhů. •U velikosti spor hodnotíme, • zda a kde vyklenuje buňku. K čemu je dobré barvení spor? Malachitová zeleň Bacillus megaterium •Spory se velmi těžko barví i po fixaci • •Chceme-li spory obarvit, musíme • použít koncentrovaná barviva za • tepla nebo různá mořidla. •Takto obarvené spory se těžko odbarvují kyselinami a jinými sloučeninami (př. alkoholem), čehož se využívá k diferenciaci spor. •Barvitelnost spor záleží na: • - jejich vývojovém stádium • - stáří kultury • - kvalitě živné půdy • - individuálních vlastnostech mikrobů •Barvitelnost spor se také (podobně jako u plísní) zlepší použitím sporulačních médií (s přídavkem manganu nebo urey). silný, špatně prostupný obal proto nelze barvících metod používat schematicky •Uložení v buňce: •terminální = na konci tyčinky • C. tetani (jakoby paličky), • B. stearotermophilus •centrální (C. histolyticum, C. novyi, • C. septicum, B. anthracis, B. cereus) •subterminální = paracentrálně = • = mezi středem a pólem buňky, nejčastěji • (C. botulinum, C. sporogenes, B. brevis) b C:\Users\Mili\Desktop\cytologie-cvika\Vase_konvertovane_preparaty\Milada\protokol4spory\b.sphaericu sccm1615.jpg •Rozšíření buňky: C. botulinum, C. tetani, Bacillus stearothermophilus • • • •mírné rozšíření: C. histolyticum a C. novyi •U některých druhů spora buňku nezduřuje: B. anthracis, B. cereus. • C. perfringens C. tetani B. cereus Clostridium botulinum Clostridium difficile B. anthracis • Klinicky významné jsou spory rodů Bacillus a Clostridium • Clostridium botulinum: • sporulující buňky odolávají 2-6 hodin teplotě 100 °C • oproti nesporulujícím, které hynou po 30' při 70 °C! • Spory inaktivovány po 20' při 121 °C vodní páry při •2 atm (0,2Mpa) a po 90´ - 180' při 160 - 200 °C suchého tepla, vysoce termorezistentní, přežijí až pětihodinový var • •v Clostridium tetani – tetanus. Ke zničení spor nutno • působit 100°C po 90 minut. • •v Bacillus anthracis – biologická zbraň, anthrax •v • •biopesticidy - Bt toxin transgen – • Bacillus thuringiensis var. israelensis Bacillus anthracis • Lidský neutrofil útočící na Bacillus anthracis spory A schematic of a bioaerosol mass spectrometry ... bioaerosol mass spectrometry (BAMS) Proces sporulace •Začíná ve fázi G1 přechodem od binárního k asymetrickému dělení •probíhá i při dostatku živin, • hlavně však ve stacionární fázi qKe studiu sporulace je qpoužíváno bakteríií rodu qBacillus, hlavně B. subtillis •Fáze 0 •Mateřská vegetativní buňka (sporangium) přechází v G1 od binárního k • asymetrickému dělení. Během sporulace B. subtillis můžeme rozlišit 7 fází (I –VII), jež lze charakterizovat morfologicky a na molekulárně biologické úrovni. Za proces vzniku endospory zodpovídá 7 – 8 genů. v průběhu vzniku přepážky (na konci G1) je již jasné, zda vznikne vegetativní buňka nebo spora •Fáze I •Tvorba axiálních filament k •rozdělení bakteriálního chromozomu. •Sporogenní zóna – jiná hustota b.mat. • Jeden z prvních signálů sporulace: vznik kvanta volutinu qDruhým signálem je zvýšení množství enzymů Krebsova cyklu a hydroláz, spotřeby acetátu •Fáze II •ukončena replikace buněčného genetického materiálu, a ten se následně rozestupuje k pólům buňky. Končí invaginace cytoplazmatické membrány. • V místě přepážky se dvojitě vchlípí cytoplazmatická membrána •Fáze III •proliferace cytoplazmatické membrány kolem obou vydělených částí buňky, u spory dochází k zaobalení (prospora - barvitelná) •Intina. extina Není dosud světlolomná Spora se nezobrazí (nesvítí při mikroskopii ve fázovém kontrastu) •Fáze IV • Tvoří se kortex spóry s PG o složení líšícím se od peptidoglykanu buněčné stěny •Ve spóře obsažena kyselina dipikolinová (stabilizuje kvarterní strukturu DNA ve vazbách) a velké množství Ca++ iontů – aktivní transport - antiport. • Endospora je již světlolomná – Nomarského a fázový kontrast. Termorezistence – k. dipikolinovaná transport do prospory •Fáze V •Syntéza pláště. •Vícevrstevný. •Již minimum vody. •U rodu Bacillus: Vzniká exosporium složené z deseti proteinů, polysacharidů a lipidů. • Chemotaxonomie – unikátní bílkoviny pláště •Fáze VI •Maturace endospory a lyze mateřské buňky, uvolnění zralých spór • • •Fáze VII •Volná zralá spóra. • Dvojité obalení spory membránou Stavba zralé spory •Jádro – představuje gelovou matrix, tvořenou bakteriálním jaderným ekvivalentem – nukleoidem, kalcium dipikolinátem (CDPA) nebo pyridin-2,6-dikarboxylovou kyselinou, jež nahrazuje vodu při udržování kvarterní struktury DNA Endospore.gif •Kortex •1) vnitřní kortex (20% kortexu) či stěnu spóry •2) zevní kortex (80 % kortexu). •Zajišťuje nepropustnost (nebarvitelný!) •Kortex tvořen peptidoglykany (PG). •Jen 20-30 % PG jednotek shodných s •jednotkami v buněčné stěně. •Zbylých 50-60 % N-acetylmuramyl–laktam, •dalších 18-20 % kyseliny N-acetylmuramové je spojeno s L-alaninem namísto tetrapeptidu. •Tyto modifikace zajišťují enzymy: • membránově vázaná Glu-mesoDmp hydroláza a • cytosolová Ac-Ala-Glu-mesoDmp lyáza. • Endospore.gif •· Perikortikální membrána •· Pláště složené z proteinů bohatých na cystein (a podobných keratinu), zajišťují odolnost spór k působení chemikálií. • výše zmíněné exosporium u rodu Bacillus • • Jedinečné a charakteristické struktury spory • •Kalcium dipikolinát •Proteiny stabilizující DNA •Kortex •DNA reparační enzymy v procesu germinace • Germinace spory – terminální, centrální •Germinací rozumíme rychlý proces klíčení spory. •Začíná spontánní aktivací spory •Aktivace – destabilizací pláště – působením teploty 70-85 °C po 5 – 10 min, • další aktivátory: malé organické molekuly, L-Ala, Ado a Ino, vyšší obsah bazí • V laboratořích zahřátí v přítomnosti vody. •Aktivovaná spora přijímá vodu a ztrácí rezistenci – bílkoviny se začínají rozkládat • • vzniklé AMK - stavební kameny nových proteinů • •Lytický enzym: p68 => p29 (kortikohydroláza) – depolymerizuje kortex pro nástupný průnik vody. •Po dvou hodinách po germinaci spory následuje dělení vegetativní buňky. •Inhibice klíčení: D-Ala, MgCl2, PMSF Klíčení spory B. cereus Exospory = cysty •Nejsou tolik rezistentní vůči teplu •Rezistentní vůči vysychání •Granula PHB – typická pro cysty •Odlišné obaly – algináty, různé polysacharidy •Nejpodrobněji popsány u Azotobacter vinelandii, • - mnohovrstevný obal (vnější části vyšší hustota), unikátní lipidy • •Za příznivých podmínek cysty klíčí • a mění se ve vegetativní buňky • • V podmínkách vhodných pro vznik cysty se vegetativní buňka zakulacuje, odhazuje bičíky Nepohyblivé stadium se encystuje Buňka se stává světlolomnou, z vnější strany depozice lipidických látek Akumulace lipidů i uvnitř buňky • • Rhodospirllum centenum – plovoucí a plazivé buňky a zároveň tvorba cyst Metabolicky neaktivní (Berleman and Bauer 2004) Berleman, J. & C. E. Bauer (2004): Characterization of the cyst cell formation in the purple photosynthetic bacterium Rhodospirillum centenum. Microbiology 150, 383-390 • Berleman, J., B. Hasselbring, & C. E. Bauer 2004. Hypercyst Mutants in Rhodospirillum centenum Identify Regulatory Loci Involved in Cyst Cell Differentiation. J. Bacteriol. 186, 5834-5841