Mikroskopické techniky, makroskopické znaky kolonií Markéta Štreitová Bi-OB-MI, 3. ročník Skupina II., 2009/2010 Cytologie a morfologie bakterií – cvičení Téma: •1) Úvod do mikroskopování • •2) Morfologie buňky • •3) Makrofoto kolonií • •Ve cvičení jsem pracovala s kmeny: •Lactobacillus brevis CCM 3805 •Serratia marcescens CCM 303 •Haloarcula hispanica CCM 3601 1) Úvod do mikroskopování •Preparáty: • nativní – využití různé světlolomnosti částic • (pozorování ve fázovém nebo Nomarského kontrastu) • – skutečný tvar a velikost buňky, pohyb, růst, • množení, obtížně barvitelné buněčné útvary • • • barvené: typy barvení: • Bez fixace buněk:- negativní – světlé buňky na tmavém pozadí • nefixujeme tzn. nedochází k deformaci • tvaru a velikosti buňky • - jednoduché (vitální test) – tvar buňky, vitalita • S fixací buněk: - diferenciační - rozlišení struktur • - diagnostické - identifikace •Pozorujeme: •v jasném poli (barvené preparáty) – viz Morfologie buňky •ve fázovém kontrastu (nativní preparáty) •v Nomarského kontrastu (nativní preparáty) • Fázový kontrast •Obraz je vytvářen interferncí paprsků fázově posunutých i neposunutých (závisí na •indexu lomu – n prostředí, kterým paprsek prochází). Rozdíly ve fázi→ změna kontrastu. •Na strukturách s vyšším n (hustší část buňky) se paprsky ohýbají více (tyto struktury •září). • → pozorování nativního preparátu → zářící spory → buňky nejsou deformovány Nomarského kontrast = diferenční interferenční kontrast (DIC) dle Nomarského Interferenční mikroskop: skládá dva obrazy ze dvou paprsků (procházejících objektem a jdoucích mimo objekt)→ dva vzájemně kolmo polarizované obrazy. • Nomarského destička v kondenzoru: rozdělení paprsku zdroje do dvou souběžných. • interference dvou paprsků po průchodu preparátem zviditelní překrytí různých fázových posunů změnou jasu → plastický 3D obraz (podle n částí buňky) → pozorování buněčných struktur např. bičíků Princip: odlišná světlolomnost částic v pozorovaném objektu – různé části buňky mají různé indexy lomu světla → vznikající obraz je výsledkem složení obrazů vln s pozunutou fází a vln odkloněných od preparátu. Ukazuje skutečný tvar mikrobiální buňky neporušené zásahem fixace a barvení, můžeme pozorovat i pohyb . Využití: - zjišťování tvaru a struktury buněk, určování morfologických znaků - pozorování růstu a množení, pohybu bakterií , - v diagnostické praxe: význam při studiu buněčných útvarů, které se obtížně barví. Nativní preparát Nativní preparát •Příprava: •Materiál a pomůcky: •Podložní a krycí sklíčko, kahan, kapátko, sterilní destilovaná voda, očkovací klička, filtrační papír, mikroskop s fázovým a Nomarského kontrastem (zn. Olympus), software pro snímání a analýzu obrazu Lucia G. • •Bakteriální kmeny: Haloarcula hispanica CCM 3601 • •Postup práce: - aseptická práce při nanášení buněk na sklíčko •• dobře očištěné podložní sklíčko vyjmeme z alkoholu, uzavřeme nádobu s ethanolem protáhneme sklíčko plamenem a položíme na tmavší podložku •• doprostřed sklíčka naneseme kapku sterilní destilované vody •• ožehnutou a vychladlou očkovací kličkou vneseme do kapky nepatrné množství kultury (asi ¼ kličky), • pečlivě rozmícháme •• kultury nesmíme nanést do kapky mnoho aby preparát nebyl hustý •• kapka se neroztírá, překrývá se krycím sklíčkem a to tak, aby v preparátu nebyly vzduchové bublinky • (nepřikládáme svrchu na kapku, ale nejprve jednou hranou, nepřitlačujeme). •• přebytečnou kapalinu odsajeme filtračním papírem. Pokud pozorujeme buňky z tekutého media, • pozorujeme přímo v mediu, bez ředění v kapce vody. • Ihned mikroskopujeme FÁZOVÝM KONTRASTEM • (objektiv 60x nebo 100x – celkové zvětšení tedy 600x nebo 1000x). • •Závěr: Pozorovali jsme rozdíly mezi fázovým a Nomarského kontrastem, které byly viditelné zejména u • sporulujících druhů (spory jasně zářily). Ve fázovém kontrastu bylo kolem buněk viditelné tzv. halo. • V mém preparátu s rodem Haloarcula (má se jednat o pleomorfní tyčky) byly přítomny kokovité buňky. • To mohlo být způsobeno záměnou preparátu nebo kontaminací vzorku. Proto uvádím fotografie jiných • druhů. Fázový kontrast D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\fazovy\B_b._thuringiensis.jpg B. thuringiensis CCM 19, řetízky tyček se zakulacenými konci, světlé útvary uvnitř buněk zde nejsou spory. Zv. 1000x. Nomarského kontrast D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\nomarsky\lb_delbrueckii2.jpg •Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CCM 7190. •Řetízky tyček. Zv. 1000x. Nomarského kontrast •Sporosarcina ureae CCM 860. •Nepravidelné koky v balíčcích (sarcinách).Zv. 1000x. D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\nomarsky\sporosarcina.jpg Buňka zadní čtveřice balíčku viditelná díky Nomarského kontrastu D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\fazovy\saccharomyces.jpg D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\Gram\saccharomyces.jpg Srovnání technik Jasné pole S. cerevisiae, zv. 1000x. „Halo“ efekt D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_I_skupina\fazovy_kontrast\bacillus cirkulans.jpg B. circulans, zv. 1000x. Zářící spora Fázový kontrast D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\nomarsky\sporosarcina_ureae2.jpg Nomarského kontrast Sporosarcina ureae, zv. 1000x. 2) Morfologie buňky • •Barvicí techniky dovolující pozorovat morfologii buněk (tj. vnější znaky buněk – velikost, tvar, popř. typ buněčné stěny: • •- Gramovo barvení – barvitelné buňky zadržují barvivo krystalovou violeť v BS díky silné vrstvě peptidoglykanu, z BS gramnegativních buněk je barvivo vymyto dobarvení -negativní barvení - obarvení pozadí, na něm vidíme světlé buňky; nezkresluje velikost buněk, po dobarvení nitra buňky můžeme odhalit případnou přítomnost pouzdra -jednoduché barvení buněčné stěny (krystalová violeť, bez fixace) - velikost buňky -barvení buněčné stěny Chanceovou metodou (krystalová violeť + kongo červeň) – dtto • •Pozorujeme v jasném poli • Lb. brevis CCM 3805, grampozitivní, krátké i dlouhé tyčky, jednotlivě nebo v krátkých řetízcích D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_I_skupina\Gram\lb.brevis.jpg Gramovo barvení •Haloferax mediterranei CCM 3361, gramnegativní, značně pleomorfní buňky. • Zv. 1000x. D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\Gram\achea3361.jpg Gramovo barvení Gramovo barvení D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\Gram\serratia.jpg Serratia marcescens CCM 303, gramnegativní, drobné tyčky, jednotlivě. Zv. 1000x. Další preparáty D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\Gram\streptococcus_mutans.jpg D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_I_skupina\Gram\bac2_ccm19.jpg Streptococcus mutans CCM 7409, grampozitivní, krátké tyčky až kokotyčky po dvou nebo v řetízcích B. thuringiensis CCM 19, grampozitivní tyčky tvořící řetízky Negativní barvení D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\Negativni\bacilluscereus.jpg Bacillus cereus CCM 2010, krátké tyčky s rovnými nebo zakulacenými konci; jednotlivě, po dvou nebo v řetízcích. Zv. 1000x. D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_I_skupina\negativni_barveni\lactobac2.7088.jpg Negativní barvení D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\Negativni\saccharomyces.jpg S. cerevisiae, pleomorfní velké buňky. Zv. 1000x. D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\Negativni\sporosarcina.jpg Sporosarcina ureae CCM 860 , koky ve čtveřicích. Zv. 1000x. D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\09\1_cviceni\1_cviceni_2_skup\Negativni\serratia2.jpg Serratia marcescens CCM 303, drobné tyčky, jednotlivě. Zv. 1000x. Lb. casei ssp. casei CCM 7088, drobné tyčky, jednotlivě. Zv. 1000x. 3) Makrofoto kolonií Makrofotografie kolonií •Pořízené fotoaparátem fotoaparát Nikon Coolpix 4500 D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\foto_cvicveni\1\IIskup\DSCN1443.JPG D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\foto_cvicveni\1\IIskup\DSCN1445.JPG Serratia marcescens CCM 303 Tvar: kulatý Profil : vypouklý Okraje: hladké Povrch: lesklý Transparence: neprůsvitná kolonie Barva : bílý pigment Makrofotografie kolonií D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\foto_cvicveni\1\IIskup\DSCN1411.JPG Sporosarcina ureae CCM 860 Tvar: kulatý Profil : plochý Okraje: hladké Povrch: lesklý Transparence: průsvitná kolonie Barva : tělová D:\Jeff\škola\3. ročník\Cytologie a morfologie bakterií\cytologie09-k protokolu\foto_cvicveni\1\IIskup\DSCN1411.JPG