2. Cvičení
Strukturální (diferenciační)
barvení
Ivana Ščigalková
Strukturální (diferenciační)
barvení
 Používá se k identifikaci bakterií (struktury
jako diagnostické znaky) a ke studiu
struktur samotných
 Barvení spor, pouzder, bičíků
 Barvení inkluzí:
– Volutinu
– Tuku
– Glykogenu
1. Pozorování spor
 Spory jsou nereproduktivní klidová stadia
vznikající jako příprava na nepříznivé podmínky
 Mohou zůstat v „mateřské“ buňce (ta při sporulaci
umírá) nebo se uvolnit do okolí
 Spory tvoří pouze některé, převážně G+ rody
bakterií (Bacillus, Clostridium aj.)
 Jejich umístění v buňce, velikost a tvar slouží jako
identifikační znak
 Jsou přítomny v kultuře určitého stáří
1.1. Barvení spor
 Velmi špatně přijímají barvivo g fixovaný
preparát se barví malachitovou zelení za
horka (5 minut se zahřívá nad kahanem)
 Buňka se dobarví kontrastním barvivem –
safraninem nebo kongo-červení
Barvení spor
 Spory oválné, zduřující buňku
Paenibacillus alvei CCM 2051T
Spory subterminálně umístěné
Uvolněné spory
Paenibacillus polymyxa
CCM 1469
Spory centrálně umístěné
Zvětšení 1000x
Barvení spor
 Spory kulaté, zduřující buňku
Bacillus sphaericus CCM 1615
terminálně
umístěné
Zvětšení 1000x
1.2. Spory ve fázovém kontrastu
 Preparát je nativní a rychle připravený –
nemusí se barvit
 Spory v preparátu září a jsou snadno
pozorovatelné
Spory ve fázovém kontrastu
 Spory kulaté, terminálně umístěné
B. sphaericus CCM 1615
zduřující buňku
nezduřující buňku
B. megaterium
CCM 2007
Zvětšení 1000x
2. Pozorování pouzder
 Pouzdro je (oproti slizu) jasně ohraničená
vnější struktura
 Chrání buňku před vysycháním, působením
chemických látek, případně před imunitním
systémem živočicha, ve kterém bakterie žije
 Samotné pouzdro se barví velmi špatně,
proto barvíme pozadí a buňku uvnitř g
pouzdro zůstane jako jediné neobarvené
2.1.1. Pouzdra – negativní
barvení nigrosinem
 Nefixovaný
preparát
 Nigrosinem se
obarví pozadí
 Roztokem
methylenové
modři se dobarví
buňky uvnitř
pouzder
Azotobacter vinelandii
CCM 289
Klebsiella pneumoniae
CCM 4985
Zvětšení 1000x
Dvě kokovité
buňky (tmavé)
ve spoelčném
pouzdře (bílé)
na šedém
pozadí
Oválné buňky
(modré) v
pouzdře (bílé)
na šedém
pozadí
2.1.2. Pouzdra – negativní
barvení kongo-červení
 Buňky resuspendujeme
v kapce kongo červeně,
rozetřeme a necháme
zaschnout
 Převrstvíme HCl,
slijeme, necháme
zaschnout
 Dobarvíme
methylenovou modří
Azotobacter vinelandii CCM 289
Zvětšení 1000x
Dvě buňky
(tmavě modré)
ve spoelčném
pouzdře (bílé)
na modrém
pozadí
3. Barvení inkluzí
 Jsou to vnitrobuněčně uložené zásobní látky
či metabolity nebo jiné látky, které se
mohou uplatnit v metabolismu
 Bez membrány nebo s jednovrstevnou (nebiologickou)
membránou
 Např.:
– Volutin (zásoba fosforu, mnoho před sporulací)
– Tuk
– Glykogen (zdroj rychle dostupné energie)
3.1. Barvení inkluzí - volutin
 Uschlý nefixovaný
nátěr buněk se
převrství převrstvení
polychromatickou
methylenovou modří
 Po 1-3 min
opláchneme a
osušíme
volutinová zrna
(tmavě modrá až
purpurová) uvnitř
buněk (světle modrá
CPL)
Saccharomyces cerevisiae
Zvětšení 1000x
3.2. Barvení inkluzí - tuk
 V buňce přítomen ve
vakuolách, ale i
strukturní v
membránách
 Kapku vody s
buňkami smícháme s
kapkou roztoku
barviva sudan III a
necháme 30min pod
krycím sklíčkem
Růžový tuk
intracelulárně
i v membráně
Saccharomyces
cerevisiae
B. megaterium
CCM 2007
Zvětšení 1000x
3.3. Barvení inkluzí - glykogen
 V buňce je s
membránou
(mnohem více) i
bez ní
 Připravíme nativní
preparát a až pod
mikroskopem
přikápneme
lugolův roztok
Hnědý glykogen (ve
vakuolách) uvnitř
buněk
Saccharomyces cerevisiae
Zvětšení 1000x
B. cereus CCM 2010