Protokol 6 Pohyb buňky Úvod: Pohyb je odpovědí na: gradient chemické látky, teplotu, světlo, gravitaci, kyslíkový gradient. Schopnost pohybu a jeho rychlost závisí na přítomnosti bičíků, počtu bičíků, lokalizaci bičíků (peritricha reagují nejpomaleji), viskozitě prostředí, gradientu koncentrace atraktantů a inhibičních látek, na paměti buňky (žádný pohyb nesmí trvat dlouho, pro správnou reakci musí buňka reagovat na aktuální podnět – krátkodobá paměť receptorů) . Rozmezí rychlosti: 1-100 μm/s Bičík - semirigidní vláknitá struktura, globulární bílkovina flagelin, tloušťka 13-20nm - vlákno je flagelárním antigenem, specifické bílkoviny; tvorba samouspořádáváním - začíná v cytoplazmatické membráně; proti eukaryotním bičíkům: jiná stavba, jiné bílkoviny, pohyb není vlnění, primární pohyb je rotační, donorem energie není ATP ale proud H^+,hnací síla: protonmotivní síla (proud H^+) (Vibrio Na^+) - stavba: bazální tělísko (G- 4 kruhy, G+ 2kruhy), háček, vlákno - bičíky snadno odstranitelné skleněnou tyčinkou - při pohybu se bičíky nezamotají díky náboji; pohyb dopředu: proti směru hodinových ručiček, buňku tlačí před sebou, rozmotání bičíků: točení na místě - chemotaxe: regulace MCP systémem – po vazbě atraktantu chemické modifikace proteinů membrány: de- a fosforylace a demethylace Rotor: 6-17 tis.otáček/min Vlákno: 200-1 000 ot/min Nerotuje konst.rychle Průměrná rychlost: 20-90μm/s 60x délka buňky/s Gepard: 25x délka těla/s Salmonella typhimurium Chi Aizawa, Teikyo University. Točivá síla je generována mezi statorem spojeným s rigidní konstrukcí buněčné stěny (k peptidoglykanu) a rotorem spojeným s flagelárním vláknem. Proteiny MotA a MotB tvoří složky statoru; FliF, G, M, a N (MS a C kruhy) jsou složkami rotoru. FlgB, C, F, a G jsou hnací hřídelí (drive shaft). FlgH a I (L a P kruhy) jsou objímkami, které vedou hřídel vnější vrstvou buněčné stěny. Vibrio cholerae G+ G- Typy pohybu: taxe – pozitivní a negativní; chemotaxe, fototaxe, aerotaxe, magnetotaxe nswimming motility – pohyb bičíky, plavání nswarming motility – plazivý pohyb kolonií, bičíky, Proteus ntwitching motility – trhavý, skákavý pohyb ngliding motility – klouzavý pohyb Důvody pohybu bakterií v nejčastější – pohyb ke zdroji živin – po koncentračním gradientu v reakce na repelent v shlukování buněk za účelem vytvoření plodnice - Myxobacteria Závislost na prostředí: MCP systém čeledi Enterobacteriaceae je urč.způsobem vyvinut u druhů žijících v prostředí bohatém na živiny, liší se tedy od systémů recepce např.u oceánských bakterií: Vibrio furnissii – živí se chitinem, vykazuje, silná odpověď na nízké koncentrace oligosacharidů chitinu, nikoli na silné atraktans např.pro enterobakterie (aspartát). Fotosyntetické Chromatium – přitahováno H[2]S (donor elektronů), což je repelent pro většinu bakterií. H. halobium přitahováno leucinem, což je repelent pro enterobakterie. Rhodopseudomonas putida – chemoatraktantem jsou repelenty enterobakterií (benzoát) MCP systém není ovlivňen růstovým cyklem buňky, , není zahrnut v údržbě buňky, ale při zvýšené intenzitě růstu. – pohyb hraje roli při kompetici limitujících zdrojů. Chemotaxe hraje roli u adherovaných buněk Caulobacter – volné plovoucí buňky – není syntéza DNA, ani dělení, ale exprese MCP – podobných receptorů – silná chemotaxe. Pohyb za signály, dokud nenarazí na povrch bohatý na substrát – osídlení a iniciace buněčného dělení. Aerotaxe: Jedna z nejdříve popsaných taxí. (1883, Engelmann). Fototaxe: Fotokineze je snížení či zvýšení rychlosti odpovědi na změny intenzity světla. Pozitivní fototaxe ve směru nižší intenzity světla. Sinice – velikost buňky umožňuje vnímat směr světla. Bakterie – fotofobní. Akumulace ve stinném prostředí. Chemotaxe: Pohyb bez atraktantu – střídání přímého a otáčivého, vrtivého. Náhodný. Pohyb s atraktantem – nižší frekvence otáčení na místě Bakterie disponuje pamětí na okamžitou koncentraci atraktantu: porovnává prostředí s předchozí koncentrací – ve směru zvyšující se koncentrace se snižuje frekvence otáčení na místě. § Pozitivní (pohyb k atraktantu) a negativní – pozorování na Petriho misce § Koncentrační gradient § Chemoreceptory – v periplazmě nebo na cytoplazmatické membráně § Atraktanty: Ø cukry (odpověď už na 10^-8 M koncentraci), aminokyseliny; Ø 20 chemoreceptorů § Repelenty Ø bakt.odpadní produkty, inhibiční agens, barviva, chemické látky Ø 10 chemoreceptorů Salmonella typhimurium, Chi Aizawa, Teikyo University Náplň cvičení: - porovnat pohyb buněk Microccocus luteus (pouze Brownův pohyb) s ostatními - příprava nativního preparátu – Nomarského kontrast - mikroskopie obarvených preparátů – fázový kontrast - očkování do polotekutého media na misce i ve zkumavce Mikroorganismy: Bacillus cereus CCM 2010 - 4h a 16ti hodinová kultura; peritrichum P. fluorescens CCM 2115T - 4h a 16ti hodinová kultura, monotrichum Proteus vulgaris CCM 1799 - 4h a 16ti hodinová kultura, peritrichum E. coli CCM 3954 - 4h a 16ti hodinová kulturaů peritrichum Micrococcus luteus CCM 169 – pro srovnání nativního preparátu Pozorování pohybu bičíku - 1) nativní preparát - kapka suspenze buněk v mediu na podložní sklo, nepřekrývat krycí, pozorování objektivem 20, nezanořovat!! Nomarského kontrast. Pro vitalitu buněk je důležitý dostatek kyslíku (citlivější buňky se hýbou jen nahoře). Je nutno opatrně proostřovat na horní část kapky – dostatek O[2] - nesmí se pracovat se skleněnými předměty (krom sklíček), př: skleněná tyčinka bičíky ulamuje (na sklíčko opatrně nanášet umělohmotnou pasteurkou, opatrně překrývat krycím sklíčkem), práce s mladými kulturami 4-16hodin!! pozorování vždy z tekutého media Barvení bičíků: Závisí na způsobu kultivace. Kultivace buněk vhodná v tekutém mediu. Staré buňky odhazují bičíky. Fixace, speciální barvicí metody pro světelný mikroskop. Barvička obsahuje mořidlo tanin, které se obalí kolem bičíku, jeho průměr se znásobí a zviditelní. Postup: a) opatrně připravíme nativní preparát na odmaštěné podložní sklíčko b) opatrně překryjeme krycím sklem c) vedle krycího sklíčka kapka barvičky d) prosajeme filtračním papírem e) pozorování pod imerzí Barvička na barvení bičíků: roztok I (10 dílů) a II (1díl), zamražený Roztok I: 10ml 5% vod.roztoku fenolu, 2g taninu, 10ml Kal (SO[4])[2] . 12 H[2]O Roztok II: nasycený roztok krystalové violeti (12g) v ethanolu (10ml, 96%) (Pozn: Elektronová mikroskopie - negativní barvení, otiskové preparáty po rychlém zmražení na -150 °C) Agar na testování pohybu: Obsahuje nízké množství agaru – je to polotekuté medium (nižší viskozita prostředí). Na polotekutý agar se očkuje vždy jen do středu misky, aby se rozrůstala 1 kolonie. Nejlépe kličkou, trošku zanořit do agaru. Pohyblivé kultury udělají rozrůstající se kruh, někdy vlnící se. Nepohyblivé rostou jen v místě vpichu do určité velikosti. Výsledky za 3-5 dní. Složení do 100ml deminerailzované vody: yeast extract (0,1g), K[2 ]HPO[ 3 ](0,01g), agar (0,2g). S miskou se nesmí hýbat. Textové pole: Proteus mirabilis •Solidní střed •Povlak •Konsolidovaná zóna •Terasy motility test medium, polotekuté Pohyblivý kmen roste i mimo inokulaci – v celém mediu Dynamika růstu kolonie: Periodicita migrace •Diferenciace plazivých buněk •Lag perioda předcházející migraci •Migrace plazivých buněk Dediferenciace •Konsolidace Regulace diferenciace Impuls pevná půda, viskozita prostředí mechanická zábrana rotace bičíků chemotaxe – glutamin Následek předání signálu inhibice dělení vlákna až 80 mm hyperprodukce flagelinu: 5000 až 10000 bičíků Způsob šíření 1.Posuvem z konsolidovaného okraje kolonie, kde jsou buňky již diferencovány a lem je organizován 2.Volným putováním z populace vegetativních buněk, kde začíná diferenciace Uspořádané diferencované buňky na okraji kolonie v přípravné (lag) periodě před migrací. Cyklus diferenciace Swarmers; plazivé buňky Swimmers; plovoucí (vegetativní) buňky) Bees a kol. (2000): The interaction of thin-film, bacterial swarming and cell differentiation in colonies of Serratia liquefaciens. J. Math. Biol., 40: 27-63 www.maths.gla.ac.uk/~mab/papersub.html www.nysaes.cornell.edu/pp/faculty/hoch/movies/ www.rowland.harvard.edu/labs/bacteria/index.html http://www.rowland.harvard.edu/labs/bacteria/projects_filament.html http://www.aip.org/pt/jan00/berg.htm www.medmicro.wisc.edu/.../research/index.html www.buddycom.com/bacteria/gnr/gnrgluox.html