Protokol č.5 Acidorezistentní barvení Acidorezistentní bakterie špatně přijímají barvivo. Barvení se proto provádí za horka koncentrovanými barvivy. Již jednou obarvené buněčné stěny si barvivo podržují i po odbarvování kyselinami a alkoholem. Acidorezistenci vykazují zástupci rodů Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, v menší míře Corynebacterium. Jejich buněčná stěna obsahuje lipidické látky, především mykolové kyseliny. Ty brání průniku barviv a tak se velmi špatně barví Gramovým barvením. Buněčné stěny acidorezistentních bakterií se neodbarvují kyselým alkoholem (1.stupeň acidorezistence) a 1% HCl (2.stupeň acidorezistence) po obarvení Ziehl-Neelsenovým karbolfuchsinem. Mikroorganismy: Mycobacterium phlei CCM 5639 – 1. stupeň - rychle rostoucí mykobakteria. Tráva (Phleum), seno. medium č.24 - 22-52°C - krátké tyčky, 1-2 um, acidorezistence 2 stupně u mladých kultur (3-4denní), více než 5ti denní acidorezistentní v rozmezí 5 – 100%. - drsné kolonie s intenzivním žlutým až oranžovým pigmentem po 2-5ti dnech - mladé kultury acidorezistentní, po 5 – 7 dnech kultivace může být barvitelnost nestabilní 2. stupeň acidorezistence: Nocardia carnea CCM 2756 Rhodococcus erythropolis CCM 277 Corynebacterium glutamicum CCM 2428 Mycobacterium Nocardia Rhodococcus Corynebacterium Rovné nebo mírně zakřivené tyčky, 0,2-0,6 x 1-10 μm zřídka větvená vlákna, netvoří vzdušné mycelium Mycelium Starší kultury: fragmentace Vláken v tyčinky a koky Obvykle tvoří vzdušné mycelium Slabé mycelium, Fragmentujíví v nepravidelné tyčky a koky Netvoří vzdušné mycelium Nepravidelné tyčinky Často svírají úhel Nebo tvoří palisády Rychlost růstu: 2-40 dní 1-5 dní 1-3 dny 1–2 dny Acidorezistence 1.stupně Nemusí být 2.stupeň Acidorezistence 2.stupně Acidorezistence 2.stupně Acidorezistence 2.stupně Špatně barvitelné Gramovým barvením, Pokud ano, tak G+ Barvitelné Gramem Barvitelné Gramem Barvitelné Gramem Penicilin rezistentní (některé druhy mohou být sezitivní, Př:M. avium) Penicilin rezistentní Penicilin sezitivní Penicilin sezitivní Pomůcky: Ziehl-Neelsenův karbolfuchsin, kyselý alkohol (96% alkoholu se 3% HCl), Löfflerův roztok methylenové modři (před použitím zředěný 1:10), 1% HCl – pro důkaz druhého stupně acidorezistence Postup Ziehl-Neelsenova barvení: 1)Příprava plamenem fixovaného preparátu 2) Převrstvit koncentrovaným karbolfuchsinem 3) Zahřát do výstupu par, pak 3 – 5 minut – nesmí vařit 4) Oplach kyselým alkoholem (dvakrát max. 15s) 5) Dobarvit Löfflerovou methylenovou modří – 30s 6) Oplach vodou Jiný postup: Postup Kenyounovo barvení – modifikace acidorezistentního barvení: Jedná se o modifikaci acidorezistentního barvení a používá se u částečně až slabě acidorezistentních bakterií. Ty jsou alkoholem odbarvovány, nikoliv však slabými kyselinami. Kyselý alkohol je zde nahrazen 1% kyselinou chlorovodíkovou. v Pro informaci: Fluorescenční barvení - detekce a diagnostika mykobakterií http://webak.upce.cz/~kbbv/Student/Vyuka/Obecna_klinicka_mikrobiologie/Laboratorni_cviceni/Navody/M ikroskopicke_preparaty.pdf http://www.sci.muni.cz/mikrob/cytologie Mycobacterium Rovné nebo mírně zakřivené tyčky, zřídka větvená vlákna, 0,2-0,6 x 1-10 μm Netvoří vzdušné mycelium Nepohyblivé. Aerobní Obligátní paraziti a saprofyti, optimum růstu je 30 – 45°C. Vysoký obsah buněčných a cytoplazmatických lipidů, s vosky obsahujícími v chloroformu rozpustné mykolové kyseliny s dlouhým větveným řetězcem (60-90C): rezistence vůči barvivům, vysychání, antibiotikům, fagocytóze Buněčná stěna – peptidoglykolipid (obsah meso-DAP, Ala, Glu, glukózamin, kyselinu muramová, arabinóza, galaktóza Kolonie s oranžovým či žlutým pigmentem, zřídka růžovým (karotenoidy). Kolonie drsné, květákovité. Löwestein-Jenssenova půda. Někdy hladké – z klinického materiálu. G+C = 62-70 mol%. cord-faktor – glykolipid trehalóza 6,6 – dimykolát ve stěně mykobakterií, významný patogenní faktor, inhibice polymorfonukleárů, funkční poškození oxidativní fosforylace Nápadný je velmi pomalý růst s dlouhou generační dobou u většiny z nich. Rod mykobakterií obsahuje několik desítek druhů, z nichž některé jsou významnými patogeny v lidské medicíně. Nepatogenní, popř. podmíněně patogenní druhy se vyskytují ve vodě, v půdě, některá u zvířat. Mykobakterie jsou intracelulárními parazity vyvolávajícími chronickou infekci s tvorbou granulomů. V obraně má význam její buněčná imunita. K diagnostice se používá přímý mikroskopický průkaz (Ziehlovo-Neelsenovo barvení, fluorescenční mikroskopie), kultivace na spec. půdách, pokus na zvířeti (morčeti), metody molekulární biologie (PCR) Etiologie tuberkulózy * v roce 1882 Robert Koch objevil tuberkulózní bacil (Kochův bacil), dnes označovaný jako Mycobacterium tuberculosis * patří do rodu Mycobacterium, čeledi Mycobacteriaceae a řádu Aktinomycetales * v klasifikaci mikroorganismů jsou mykobakteria řazena na rozhraní mezi vyššími organismy, houbami a plísněmi a pravými bakteriemi (název je odvozen od řeckých slov mykes – plísně a bacterion – tyčka) Rozeznáváme mykobakteria klasická, vyvolávající tuberkulózní onemocnění, a netuberkulózní mykobakteria, vyvolávající mykobakteriózy (M. kansasii, M. avium). Ke klasickým mykobakteriím řadíme: * Mycobacterium tuberculosis – patogenní pro člověka, * Mycobacterium africanum – vyskytuje se převážně v tropické Africe, v Evropě zcela výjimečně, patogenní pro člověka, * Mycobacterium bovis – patogenní pro skot i pro člověka * základní vlastností mykobakterií je acidorezistence a alkoholrezistence – příčinou je vysoký obsah tukových látek v těle mykobakterií * tvarově jsou rovné nebo lehce zahnuté, granulované tyčinky, s oblými konci o délce 1 – 4 μm. Mohou být izolovaná nebo podélně uspořádaná ve shlucích. * kritická teplota, při které dochází k denaturaci mykobakteriálních proteinů a mykobakteria hynou, je 60ºC * chlad, a to i teploty blížící se absolutní nule, bakterie nepoškozují, ve zmrzlém stavu vydrží i léta