„Next-Gen“ Sequencing
Boris Tichý
27.11.2012
LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapie

Nové technologie (od r. 2005)
Massive parallel sequencing
Statisíce až miliardy paralelních sekvenací
Klonální amplifikace/sekvenování
Jednotlivé sekvence odpovídají jednotlivým molekulám DNA/RNA
Single molecule sequencing
Techniky pro přímé sekvenování jednotlivých molekul DNA/RNA
2010 → řada dostupných technologií
454, Illumina, SOLiD, PacBio, Helicos, IonTorrent, Complete Genomics

Klonální amplifikace
Emulzní PCR (emPCR)
454, SOLiD, Polonator
PCR reakce uzavřeny v mikroreaktorech
Kulička, enzym, nukleotidy
Voda v oleji

Klonální amplifikace
Bridge amplifikace
Illumina
Templát i PCR produkty fixovány k povrchu flow-cell
Vznik “clusters”

Sekvenování
Sekvenování syntézou
Illumina, Helicos, Pacific Biosciences, IonTorrent, 454
Reverzibilně terminační, fluorescenčně značené nukleotidy
Illumina, Helicos
Fluorescenčně značené nukleotidy
PacBio (SMRTTM)
Neznačené nukleotidy
IonTorrent (změny pH), 454 (pyrosekvenace)

Sekvenování
Sekvenování ligací/hybridizací
SOLiD, Polonator, Complete Genomics
Hybridizace a ligace fluorescenčně značených sond
Ligáza připojí sondu k primeru
Sonda – degenerovaná, známý je pouze nukleotid na sekvenované pozici
Single nebo two base kódování
Většinou jen krátké úseky

Sekvenování
Dlouhé vs. krátké
SOLiD – max. 75b
Illumina - max. 250b (500b paired-end)
Roche (454) – max. 800b
PacBio – až 10.000b
Další generace?
Single molecule
Nanopores
Electron microscopy

Využití
Stejné nebo širší jako microarrays
Celogenomové sekvenování (resekvenování i de-novo)
Lze objednat, od ~ $10.000 (výzkum od $4.000)
Deep sequencing (sekvenování s vysokým pokrytím)
(pokrytí = počet přečtení konkrétní pozice)
Sekvenování mikrobiomu, metagenomika
Epigenomika
Genová exprese
BGI – největší sekvenační centrum (Čína)
> 130 přístrojů poslední generace
Kapacita > 1 900 000 000 000 000 bazí ročně (~ 300.000 lidských genomů)