Somatické kmenové buňky - SSCs (Somatic stem cells) Podílejí se na regeneraci tkání, orgánů a homeostázi obecně Mnohé jsou minimálně multipotentní Kromě profesionálních SSC, existuje i množství fakultativních typů Případná pluripotence nebyla dosud prokázána i-1 Jak vypadají, jaké mají vlastnosti a schopnosti ? Mají adultní SSCs stejný potenciál jako embryonální SSCs? Jsou všechny stejné, podobné, tkáňově specifické ? Lze je kultivovat in vitro ? Kde se nacházejí? Jsou nesmrtelné? „Existují?" I J ADULTNÍ x EMBRYONÁLNÍ somatické kmenové buňky Embryonální somatické kmenové buňky - Během embryogeneze dávají vznik tkáním a orgánům - Případná pluripotence nebyla dosud prokázána - Během časné embryogeneze se intenzivně dělí, později již méně (???) - Lze je izolovat a množit in vitro (zatím pouze po omezenou dobu) - Pravděpodobně jsou schopné transdiferenciace (?) - Tvoří solidní nádory (možná i teratomy?!?) po injikaci do imunitně tolerantního organismu (všechny ??) - Ačkoliv jsou v mnoha ohledech podobné somatickým kmenovým buňkám z dospělého organismu (mnohé znaky, podmínky kultivace a izolace), je již jasné, že stejné nejsou. Původ SSC gastrulation r. ectoderm mesoderm endoderm HC nervous tissue/NSCs skin/skin SCs bone marrow and blood/HSCs and MSCs muscle and bone/tissue SCs lung, liver, and pancreas/organ specific SCs esophagus, stomach, intestine/intestinal SCs primordial germ cells gastrulation ectoderm = mesoderm L endoderm nervous tissue skin bone marrow, blood muscle, bone lung, liver, pancreas esophagus, stomach, intestine primordial germ celis multipotent stem cells NSCs/skin SCs HSCs/MSCs/tissue SCs organ SCs/intestinal SCs kmenové buňky (aktuální) přechodně se dělící progenitory potenciální kmenové buňky funkční terminálne diferencované buňky přechodně Se dělící buňky - TA (transiently amplifying) Odhad generačních cyklů od kmenové buňky po funkční / terminálne diferencovanou buňku pro různé typy tkání u myši Functional cells .o stern cell Bone marrow (Hae mopoiesis-b road pkiripotentiaiilty) Large intestine Small intestine (Jimited pluripotentialilly} Epidermis (keratopoiesis) Testis {Spermatogenesis, significant spontaneous cell death) Tongue 2 3 4 50 33 20 4 5 6 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 11 6 3 1.5 0-4 0.1 0,02 CelE divisions Amplification Number of stem cells as a % of total proliferative cells Dividing transit Functional Cells NICHE a jak být profesionální kmenovou buňkou Stejně jako je v současnosti obtížné fyzicky uchopit jednotlivou SSC je velice těžké poznat, jak vypadá a jaké vlastnosti má prostředí, kde se SSCs nachází = niche. Profesionální SSCs mají tzv. nezralý fenotyp, tj. připomínají buňky značně časných vývojových stádií (z hlediska vývoje organismu / ontogeneze). Předpokládá se, že v závislosti na potřebách organismu buď vůbec neproliferují nebo jen pomalu. Intenzivnější proliferace se předpokládá v odpověď na poranění dané tkáně případně její jinou nedostatečnost. Tato proliferace, v odpověď na poranění, je in vivo u některých tkání, např. nervové, značně nedostatečná a tkáň má tak velice malou schopnost regenerace, na rozdíl např. od epitelů. Pro mES je „niche" feeder + LIF + nedefinované faktory séra (BMP není plně dostatečné z dlouhodobého hlediska). Je to jediný „dokonalý" niche který umíme navodit v in vitro podmínkách, paradoxně u kmenových buněk, které přirozeně neexistují. In vitro, však při vhodné manipulaci a za dodržení výše uvedených podmínek mES představují nejhomogenější a ve vlastnostech i nejstálejší populaci kmenových buněk (2007 :o)). Zánik niche = zánik/diferenciace kmenové buňky. Opačný proces, navození niche (kdyby jsme ho znali) kolem progenitoru nebo terminálne diferencované buňky nevede ke vzniku buňky kmenové (analogicky k pokusům s ES a dalšími o SSCs „obohacenými" populacemi SSCs. Je to pravděpodobně v důsledku ireverzibilné (z pohledu možností extracelulárního působení) změněných regulací „intrinsic" faktorů, které si SSCs zachovávají z časných vývojových stádií ontogeneze. Toto dokazují i pokusy s exogeními expresemi takových faktorů v různých populacích dělících se buněk (viz. reprográmování buněk). Jak očekáváme, že profesionální SSCs vypadají Měly by exprimovat „stemness" geny (které to ale jsou?), analogické geny s ES buňkami nebývají tak silně exprimovány, jak to známe právě u ES buněk, pravděpodobně tu hraje svou roli pluripotence ES buněk oproti multipotenci SSCs, kdy tzv. „stemness" geny ES buněk jsou spíše geny exprimované pluripotentními buňkami obecně. => Stemness qeny X Stemness regulace (signální dráhy/epigenetika) Předpokládáme, že mají vysokou hladinu inhibitorů cyklin-dependentních kináz (p2<|wafi/cipi pi5iNK4B pi6'NK4A p pomalá proliferace/semi-quiescence. Toto je velký rozdíl k ES buňkám, které jsou take intenzivně proliferujícími, na rozdíl somatickým kmenovým buňkám v tkáních dospělého jedince. Z „extrinsic" faktorů se předpokládá významná úloha drah TGFp rodiny, Wnt, Notch, a gp130, v souvislosti s vlastnostmi „niche" pak také signalizace přes kadheriny a buněčné adhezivní molekuly (CAM - cell adhesion molecule) v jejichž signalizaci jsou MAPKs, (3-catenin, NFkB,...=> klíčová je rovnováha Jsou obecně odolné k toxinům (MDR - multidrug resistance proteins, ATP pumpy), ale i k tvrdému záření (paprsky X, y-záření). Dělení genomu u progenitorů/kmenových buněk při asymetrickém dělení First round of DNA replication, cell division (ED DNA Replication -► /i CldU Cytokinesis Second round of DNA replication, cell division <0) Äff DNA Replication s?*\ IdU li li o \ Conboy 2007 Daughters indistinguishable ** * * Hoechst First Label Second Label Merge (CldU) Daughters distinguishable Četnost asymetricky a symetricky dělících se kmenových buněk kosterní svaloviny in vitro - potvrzení výše uvedené hypotézy Sca-1 - znak kmenové buňky koserní svaloviny Desmin - protein charakterizující myoblast (časný progenitor svalové buňky) Hoechst Brd U Desmin Merge * * * Hoechst Desmin Sca-1 Merge Ii -II» I I » o. S "C m rä o =1 £ 25 BrdU + :-Desmin +; - +: - - ; 4- + Brdu* Desmine Brdu-, Dcsrnin-Brdu+ Desmin-Brdu-, Desmin* Desmin Sca-1 i : ■ + +: -+ ■ - O Desmin+, Sca-1-O Desmin-, Sc*H O Desmin+, Sca-1 + O Desmin-. Sca-1- o, +: - Conboy 2007, Populace vedlejších buněk (SP - side population) = SP buňky - izolovány z různých tkání jako buňky schopné intenzivně vylučovat DNA vázající fluorochrom Hoechst 33342, díky tzv. proteinu rezistence k farmakům = Abcg2 (BCRP - breast cancer resistence protein; rodina „multidrug resistance transportér proteins"-MDR; obecně ABC (ATP binding cassette) transportéry) ■ později prokázán fenotyp Sca1+/lin+"), byly isolovány z mnoha typů tkání i z nádorových (kostní dřeň, mléčné žlázy, plíce, svaly, srdce, játra, mozek, kůž, .... a to jak u myši, potkana i člověka) - Jsou detekovatelné i v některých nádorových buněčných liniích (C6 - gliom; IMR-32, JF - neuroblastom; a různých gastroitestinálních nádorových liniích) Přes výše uvedené společné znaky SP buněk, jsou tyto buňky tkáňově specifické SP svalů mají myogení (Sca1+/CD45) a hematopoetický potenciál (Sca1+/CD45+) Hematopoetické SP jsou Sca1+/CD34+ nebo (?) CD34" SP kůže jsou Sca1+/K14+/K19+ SP z mozku, ale i pankreatu (!) jsou Sca1+/nestin+ ABC transportéry - ABC transmembránové pumpy (transmembránové transportéry obsahující ATP vázající doménu) (ATP binding domain) v různé míře jsou přítomny v membránách většiny / všech buněk (rostlin, živočichů, mikroorganismů) účastní se transmembránového transportu různých typů látek, zejména lipofilních jsou rozděleny do několika rodin (člověk má 48 známých ABC transportérů) - ABCA, ABCB (MDR), ABCC (MRP, CFTR), ABCD (ALD), ABCE, ABCF a ABCG (BCRP) Doménové uspořádání lidských ABC transportních proteinů. Membránový model proteinů ABCB1 - celý transportér, ABCG2 - poloviční transportér. NBD - nucleotide binding domain, TMD - transmembrane domain (Sarkadi 2006). ABCB-type I 18498491 ABC transportéry vylučující chemoterapeutické sloučeniny Transportér Alternativní j méno Lékové substráty ABCA2 Estramustin ABCA3 Daunorubicin ABCB1 MDRl/p-glykoprotein Anthracykliny, etoposid, imatinib taxanes, mitoxantron, vinca alkaloidy ABCB4 MDR2 Paclitaxel, vinblastin ABCB5 Doxorubicin ABCB11 BESP Paclitaxel ABCC1 MRP1 Anthracykliny, etoposid, methotrexate ABCC2 MRP2/cMOAT Cisplatin, doxorubicin, etoposid, methotrexat, mitoxantron, vinca alkaloidy ABCC3 MRP3 Cisplatin, doxorubicin, etoposid, methotrexat, vinca alkaloidy ABCC4 MRP4 Methotrexat, thiopuriny ABCC5 MRP5 6-Mercaptopurin, 6-thioguanin ABCC6 MRP6 Anthracykliny, etoposid, teniposid ABCC10 MRP7 Docetaxel, paclicate, vinca alkaloid ABCC11 MRP8 Purine and pyrimidine nucleotide analogy Mitoxantron, methotrexate, topetocan, ABCG2 BCRP/MXR SN-38, imatinib, flavopiridol, anthracycliny Raaijmakers a kol. 2007 mouse bone marrow A549 none F- -C 3 8 red fluorescence {650 LP) Příklad detekce buněk s vysokou expresí ABC transportérů. A549 - nádorová linie, FTC - fumitremorgin C (inhibitor aktivity ABC transportérů) Model funkce ABC transportérů Normal Cell MDRCell SSC „mezodermálního" původu Mezenchymální kmenové buňky (MSCs - mesenchymal stem cells) buňky tkání mezodermálního původu, snad i krevní elementy, asi ne buňky ledvin, + Hematopoetické kmenové buňky (HSCs - hematopoietic stem cells) krevní elementy, + Zdrojem adultních SSC mezodermálního původu je zejména kostní dřeň Adultní multipotentní progenitorové buňky -MAPCs (multipotent adult progenitor celis) - „Jejich existence je velice kontroverzní" - propagátorkou je Catherine M. Verfaillie (Jiang, 2002) - MAPCs byly poprvé izolovány z kostní dřeně, později i z mozku a svalů - na rozdíl od ostatních SSC jsou to proliferující buňky s vysokou aktivitou telomerázy - v kultuře lidských a krysích MAPCs nebyly nalezeny aneuploidie, u myší ano (u myší časté i pro jiné buňky včetně ES???) - v kultuře in vitro vyžadují „nízkou" denzitu (m, r 500-1000 b./cm2; h 1500-3000 b./cm2) - velmi náročná kultivace (fibronectin, EGF, PDGF, LIF, velké objemy pro obdržení dostatečného množství buněk pro analýzu) - in vitro dávají vznik řadě typů buněk včetně neurálních, čistota diferencované kultury 70-80% - in vivo, po injikaci do blastocysty tvoří chiméry (schopné narození) s chimerismem 1-40%, avšak schopnost tvořit zárodečné buňky nebo celé embryo (injikace do tetraploidního trofektodermu) nebyla prokázána - netvoří teratomy - není jasná jejich existence in vivo - není známý specifický marker antigen exprese blízké SC MHC-I - MSC +++ CD44 (H-CAM) různé buňky CD105 (endoglin) - MSC +++ CD34 (L-selectinR) - HSC +++ CD45 (tyr. fosfatáza) - HSC +++ cKit (CD117, SCFR) - HSC +++ Thy1 (CD90/CDw90) + HSC +++ AC133h/Sca1*m + HSC +++ SSEA1 m mES +++ Oct4 m m+hES +++ Rex1 m mES +++ negativní „-", ne vždy negativní„+/-", slabá ,,+", mírná ,,++", silná ,,+++" *Sca1 - stem cell antigen, GPI (glykosylfosfoinositolovou) kotvou vázaný protein v cytoplasmatické membráně zejména „velice časných" progenitorů Stanovení p-galaktosidázové aktivity na sagitárním řezu u normálni myši (i) a chimérické myši s ROSA26-MAPCs (j). mozek >4 í l5 - V koster, sval. * ROSA26 myši exprimují ve všech bunkách p-galaktosidázu (transgení myši - GMO) játra ledviny —% -:■ . : -J , r? ■ í - ' '""1 * i.' ' * 1 -1 (V. ■ 1 .i . ■' i x* *-K 'pL-:1 - - j- ... ň* kůže srdce tenké střevo slezina Jiang,2002 Mezenchymální kmenové buňky - MSCs (mesenchymal stem cells) Kmenové buňky kostní dřeně - BMSSCs (bone marow stroma stem celis) Kmenové buňky svalové tkáně, chrupavky, kosti, .... Proliferation Commitment Lineage progression Differentiation Maturation Osteogenesis Transitory osteoblast Mesenchymal stem cell Caplan, 2001 MSG proliferation Chondrogenesis Myogenesis Transitory Chondro cyte Q \ Chondrocyte Hypertrophic chondrocyte Cartilage Myoblast fusion Myotijbe Muscle Marrow stroma Transitory stromal cell Unique micro-niche Stromal cell Marrow Tendogenesisl ligamentogenesis Transitory fibroblast Ottier 1SL fibroblast Adipocytes, dermal and other cells Tend onjl i g a me lit Co nnect ive ti s s li c MSC lze izolovat z mezenchymálních tkání (kostní dřeň, svaly, dermis, tuková tkáň, chrupavky, kosti, ale i z krevního oběhu (zde se někdy označují jako pericyty), zejména však z kostní dřeně. Přesný fenotyp není znám, pracuje se se směsnou populací buněk, která po indukci příslušnými kombinacemi růstových faktorů je schopna dát vznik buňkám dané tkáně. Na rozdíl od MAPCs exprimují proteiny MHC-1, a byly připraveny protilátky (SH2, SH3 a SH4) se zvýšenou afinitou k MSCs. S věkem jich v organismu ubývá. Jsou komerčně dostupné, jejich aplikace v medicíně je ve fázi klinických zkoušek. Přes velkou snahu mnoha týmů, pluripotence nebo transdiferenciace v buňky jiného zárodečného listu nebyla dosud dostatečně věrohodně potvrzena. Mechanismus zapojení MSCs v regulaci homeostáze homeostáze podpůrné/růstové faktory (TROPHIC) MSCs f BIOAKTIVNÍ FAKTORY munosuprese Mechanismu nepřímého zapojení MSCs (a jejich derivátů?) do procesů regenerace jako lokálního zdroje růstových faktorů MSCs as Trophic Mediators Angiogenic (VEGF) Anti-apoptotic >^ \ Ani i-acarring Trophic^ ® \^ 3, Miiohc Caplan,2006 MSCs MOBILIZATION (G-CSF? others?} MSCs se aplikují v případě - infarkt myokardu - reparace tkáně menisku - Crohnova nemoc (imunosuprese) Kmenové buňky stroma kostní dřeně - BMSSCs (bone marrow stroma stem cells) nejasný fenotyp, ale snadno získatelné ve směsných populacích z kostní dřeně, jako buňky adherující na plastik pro tkáňové kultury (na rozdíl od buněk hematopoetických řad) potenciál: osteoblasty, chondrocyty, mesenchymální, fibroblasty, myocyty (srdeční?) - indukce in vitro kokultivací s cílovou tkání, kultivace v tkáňově specifických médiích fibroblastům podobné buňky (a) větší, a b) menší, zřejmě progenitory) MAPCs jsou někdy označovány jako podskupina (subset) BMSSCs (pluri- x multipotentní???), celkově se ale překrývají s MSCs, obecně je možné, že rozdíly mezi typy jsou dány spíše selekcí, způsobem izolace a nasměrováním k některé diferenciační dráze, než skutečnými rozdíly in vivo. v závislosti na kultivačních podmínkách velmi rychle mění morfologii, což pravděpodobně vedlo k podezření na jejich pluri-/multipotentní schopnosti (zejména vznik neurálních b.) velká schopnost fúzovat se mezi sebou i s ostatními buňkami -> falešné výsledky - vznik heterokaryonu, ale i Polyploidie, vznik heterokaryonu prokázán V současné době nejsou plně objasněny vztahy/hierarchie mezi MSCs - MAPCs - BMSSCs - (+ některé SP) a případně dalšími somatickými kmenovými buňkami, stejně jako rozdílnost MSCs z různých tkání. Je možné, že mnohé pozorované rozdíly jsou dány postupy izolace daných buněk, jejich kultivací in vitro nebo případně i dalšími nedostatky v přípravě vzorků apod. Svalové SC - kmenové buňky kosterní svaloviny = MuSC v embryogenezi somity-> myotom -> myocyt -> svalové vlákno v dospělosti MuSC -> satelitní buňky -> myocyt -> svalové vlákno (kostní dřeň) (povrch svalového vlákna) MuSC nejsou dosud přesně definované, náleží snad k užšímu výběru MSC? in vivoje sval regenerován satelitními buňkami, majícími vlastnosti SC satelitní buňky se u myši objevují 17.5 dpc, s nástupem tvorby sekundárních svalových fibril (13 dpc. objevení primárních sv. fibril) Stem Cell, Adult Pax7 Eya2 Six1 Dach2 Myogenic Precursor Cell Satellite Cell Paxľ MRF4 Myogen! n Původ satelitních buněk Salemierall inlersMlsi cells Myofibril Dále byly izolovány z adultního kosterního svalu buňky CD34+/Sca1 + jako kmenové buňky odvozené ze svalu (MDSC - muscle derived stem cells) Satelitní buňky kosterní svaloviny a jejich úloha v regeneraci svalu M-cadherin desmin jádra ^^^^^ Morgan2003 Dynamika regenerace kosterního svalu Pax-7 ■ » Morgan2003 sarkolema □ bazálni membn ■ riíic \ B 1 á* Mechanismus regenerace svalového vlákna MuSC/satelitními buňkami (MSC) MPC - myogení progenitor .TiyoJlMTrlUCta ŮuieEcanl ví;.' Cd 34 caus r:K(Hirywg csllg l v MyůD De* Shi2006 marker Satelitní buňky spící, časné? (quiescentní) Satelitní buňky spící (quiescentní) Satelitní buňky aktivované Pax-7 + + +++ cMet (HGFR) + + + m-cadherin - + + CD34 (L-selectinR) - + + Myf-5 - + + MyoD* - - + Overexprese MyoD u fibroblastů je diferencuje do myogeních buněk i 11 11 El J]lí r i j ntriili I ij I TIMM in ni i niti. i : mi ; 111 ■ 11 i mi . 11 li m. -iní i.UJiLtti i I i I i j Fl i KM [ t i 11 li i i r [ i i" ■ ■ in e ct n ÍEH£E> in I I I TT I E I I I I . I I I I I I I 1 I I I t I I I i. ii 1111 11 n 111 nutí 111 r i ■ n 1111 e 11 I : : I 1 I I I i I I I " I I I I " I I ' I I i I ; I : I I I í I I i 11 I I I I i I I I.....1 I t i 1 I I I 1I HlIlHÉU I I 11 I I I I I I 11 : I I I I I I I : 1 I I I N l'F I I I Lí 11: I I 1T 1 I I I I I IL i I r I 11 I I N I I I Ij I I I I I ľ M ľ UfllJSÉlJIJT I TI I TI iii I I J I I 1 11 I I L"FF.ľIl 1" ..........m 11 n 111 11 i i i I.........íl i i i: i i 11 i 11111 iL 111 i N I i I 11L r 1111 :11 I ■ I L : : I : : I I I 1 I I I I iii I l I t L I I I 1 I 1 I I I ii I Jbqpjarjfc,1 I : I ■ I I I iii nmmmii nsm mu ■einri iiinvBi i 11 i: i r i i i ii 11 m 1! E11UH r i i 11: i i ;. i " ninniiinii ľ E I I L I M ! I I i I 1 I I 11 TI E E I LI EEL J 11_? 1 iiľi pi Ér 11111 j iStsc I ; 11 i : P I I i I i i i : 111 I I H J kli l.tl.l \ i. i : i: i i \ti e i p-r r i i MIHIH ^ I--L flŤIfcľľH I i E1 M i I i i l-l Ml LI i t II IUI El ranil Iď 711 Bia::? oo 0 00 00 —II 11 um II1111 ...... 11 11 I I "i r m 111111 im i i 11 U IUI iL i I I I i t i M 111: ľ I L-1 i I Im! II I I I I 1 i i I I ILM m 11 n ii ľ L J J. ľ I i i I i I J] I I M I I J Morgan2003 II I I ;I L i I I i j II I Ll i Ml Iii: i l i i i j 11 l 111 i m 111 11] i ££££ i . i i rrrr¥írT-TT-TTPTi:T7TlliTriFÍCÍTHtTMlilMíŕ íi ni 111 m i i : i i r n i ;TtfHHU?-CllBPi:l£lltIJlI£l I [ I M I l"[ I I I I I I I I I I I I I I I ! ; i i i:" 111 11 - r = i ■ 11 u ■ ■ ......i.i m UUUfnilillEZllIftE-tJT "i . i ■i : i i i i L i 111 M i i i i J m^iiiniaai lii ep r 11 i m Iii íi ĺ mi tiet ťii I l-Ťll UtPFK I i-* ■■■■■■■■lil Mechanismus regenerace svalového vlákna satelitními buňkami. Aktivace satelitních buněk (IGF 1,2, HGF,..) Fůze satelitních buněk Regenerace svalového vlákna Pupečníková krev obsahuje hematopoetické progenitory existující, jako pozůstatek extraembryonálních krevních ostrůvků a endotelie. Díky tomu, jsou tyto buňky geneticky shodné a fenotypově velice blízké vlastním krevním buňkám embrya a je možné je tak snadno použít jako transplantační štěp pro z tohoto embrya vzniklého jedince. Jejich množství lze navíc navýšit indukcí jejich proliferace koktejlem pro-hematopoetických cytokinů. V současnosti bylo publikováno, že pupečníková krev může být také zdrojem mesenchymálních buněk, snad podobné MSCs i s jejich potencí. Tyto výsledky je však treba jeste důkladné ovent. Epe o- ExGcoefom Btood island Amnion Yjlk cavjly Trophoblasl gřanl ceSIs Chorionic ectoderm A.Hantoi.'; Visceral endoderm Definitive endoderm 7.5 dpc 12.5 dpc - jednovrstevný dlaždicovitý epitel tvořený endotelovými buňkami adherovanými k bazálni membráně - tvoří výstelku cév případně cévy samotné (mikrokapiláry) - v případě cév jsou z druhé strany bazálni membrány buňky hladké svaloviny a podle typu orgánu také množství pericytů (viz. mesenchym), pericyty jsou i v mikrokapilárách - endotel je prostupný pro pericyty, monocyty/makrofágy, leukocyty a lymfocyty - endotel je také významným zdrojem mnoha růstových faktorů, díky tomu hraje významnou úlohu v homeostázi dané tkáně - obnova endotelu probíhá z endotelových progenitorů (kmenových buněk?), které jsou vmezeřeny mezi endoteliemi, případně plavou v krevním řečišti. - některé práce ukazují na společného předchůdse endotelií a HSCs (CD31+/- - PECAM1 (Platelet endothelia cell adhesion molecule 1), CD34+, CD45+) případně také na schopnost vzájemné transdiferenciace těchto dvou buněčných populací. Adultní progenitory pro hematopoézu a endotelie byly isolovány z krve a kostní dřeně s fenotypem CD34+, Flk-1 +, AC133. Podobně bylo prokázán společný progenitor v průběhu embryogenéze pro endotelie a buňky hladké svaloviny. Jestli takový progenitor existuje i v dospělosti není dosud známo. Srdce, srdeční sval a jeho regenerace Kardiomyocyty + Endotelie + specializované svalové buňky Hisova svazku a Purkyňových vláken + SP apod.?? + vazivo (fibroblasty)? Srdeční sval muže mohutnět zejména hypertrofií svých buněk, ne jejich namnožením, a tak možnosti autonomní regenerace po poškození jako je infarkt myokardu, ischemie apod.., jsou značně omezené. Proto jsme se domnívali, že myokard neobsahuje zásobu progenitorů k reparaci. Navíc se dělení pre-kardiomyocytů zastaví v průběhu embryogeneze, stanou se senescentními a jejich počet se během života již za normálních okolností zásadně nezvětšuje. Některé recentní práce však ukazují, že i u srdce můžeme předpokládat jisté regenerační schopnosti, a to díky zbytkovým progenitorům kardyomyocytů proliferovat v odpověď na poškození. Byla také prokázána schopnost regenerace srdce cirkulujícími progenitory, jak ukazují sex-mix transplantace srdce. Analýza distribuce X chromosomu ukázala, že se pravděpodobně nejedná o fůzi buněk, ale o diferenciaci progenitorů (SCs ?), přesto jiné práce prokázali jen fúzi mezi buňkami. Tyto regenerující buňky jsou pravděpodobně SP a c-kit+ buňky kostní drěně (MSCs?)1), i po injikaci, se přednostně usazují např. v místě ohraničujícím infarkt2). Mechanismus regenerace srdečního svalu nemusí však být spojen přímo s diferenciací těchto zde se akumulujících buněk, ale může být vyvolaný také růstovým faktory, které tyto buňky produkují (viz. MSCs) a tak stimulují buď samotné kardiomyocyty, nebo a to spíše endotelové buňky vystýlající místní cévy. Endotel snad sám o sobě má regenerační schopnosti pro některé tkáně3). Není však dosud jasné zda tento regenerační (transdiferenciační ?) potenciál mají samotné endotelie nebo další typy buněk nacházející se v přímém kontaktu s endotelem (SP buňky, MSCs?, fibroblasty). 1> MSCs, SP buňky, BMSSCs, MAPCs, se "v malém množství vyskytují i v krevním řečišti. V návaznosti na požkození organismu, podle některých teorií, se počty těchto buněk v krvi zvětšují. 2) „Signál poškozené tkáně". Cirkulující (i např MSCs / BMSSCs) progenitorové a kmenové buňky mají tendence (zřejmě podobně jako buňky imunitního systému) akumulovat se v poškozené tkáni. Podstata tohoto signálu není přesně známa. Zřejmě je však podobného charakteru jako známe z imunitních reakcí a z procesů regenerace (chemoatraktanty - chemotaxe, pathotaxe) 3> Je podezření, že endotel může dávat vznik hematopoetickým progenitorům (viz. např. hematopoéza v stěně dorsální aorty (AGM) embrya a extraembryonální prvotní krevní ostrůvky průběhu embryonálního vývoje atd.. New myocyte formation Myocardial mass Terminally differentiated myocytes // * Myocyte Joss // * 9 Stern and progenitor cells in Cycling immature myocytes Myocardial mass Nonreplicating, terminally differentiated myocytes r Dying myocytes Aging myocytes p16P0fi Figure 1 Two views of myocardial cell homeostasis. (A) Prevalent view of cardiac cellular homeostasis, where renewal and cardiac stem and progenitor cells (CSCs) are ignored. (B) New view of the myocardium, incorporating the existence and role of the CSCs. Hypotetické možnosti regenerace srdečního svalu Progenitory „kmenové buňky" z krevního oběhu Spící progenitory kardiomyocytů (SCs?) Proliferace kardiomyocytů - spíše ne! Skutečně existují kardiomyogenní progenitory nebo kardioSC? -zdá se, že ANO. (Torella, et al., 2006) Table 1 The four types of resident cardiac stem and progenitor cells identified so far and their salient characteristics. Characteristic Type of cell c-kit Sca-1 MDR-1 lsl-1 Cardiac differentiation Yes Yes Yes Self-renewal Yes Yes Yes Yes Clonogenic Yes Yes Yes Not known Multi potent Yes Yes Yes Not known Cardiosphere3 formation Yes Yes Yes Not known Present in adult/fetus Both Both Both Fetus to adult References 13, 16 and unpublished 23, 24 and unpublished 25 and unpublished 11 aPseudo-ernbryold bodies (a marker of multlpotency) when cells are grown In suspension. Figure 2 Human cardiac stem cells and their process of in situ lineage commitment. (A-C) Three clusters of c-kit+ cardiac stem cells (CSCs; green, arrows), located in proximity to acute infarcts, are shown. The infarcted myocardium (Ml) is apparent in (B). Myocytes are labeled by a-sarcomeric actin (red) and nuclei by 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blue). (D) Committed human CSC (hCSC) expressing c-kit (green) and the myocyte transcription factor MEF2C (yellow dots), representing myocyte progenitors. (E) Committed hCSC expressing c-kit (green), MEF2C (yellow dots) and cytoplasmic a-sarcomeric actin (red), representing myocyte precursors. (F) Small developing myocytes (a-sarcomeric actin, red) express MEF2C (yellow dots) and have lost the stem cell surface antigen. Connexin 43 is detected between some of these maturing cells (green, arrows) as an expression of their electrical coupling. (G,H) A single smooth-muscle-cell precursor positive for c-kit (green), the transcription factor GATA-6 in nuclei (white dots), and a-smooth muscle actin (red in H) is shown. (I-L) An endothelial cell progenitor (I,J) and an endothelial cell precursor (K,L) are illustrated. Both cells express c-kit (green), Ets1 (yellow), and flkl (magenta in L). (A-L) Scale bars, lO^m. Adapted from reference 18 © (1993-2005) The National Academy of Sciences of the United States of America._ Multipotent Bipotent Transient Progenitors Progenitors Intermediates Schema kardiomyogeneze WmJfj-cattp^ / _ TT Differentiated Progeny ---► isl-l* \ cTnT* Wnt/ß-cat 0> —■ vfl Bmp-2fSmad-1 t ^ ^ MICP^ MesodermaJ Precursor Pool Of Common Primordial Cardiovascular Progenitor : ' Nk*2.5+ / SHF c0 teMt - - *- N*jfZ5+ c-K/H-? Mfex2$» v SMAfP Blood Lineage Endothelial Lineage C-Krl-:' SM-MHC* cTnT* HCN4+ cTfiT* Mtc2-a* CD3U vWf* cTnT* Smooth Muscle Cell Right Ventricular* Cardiomyocyte & OFT Myocardium? Atrioventricular Nodal Cell Atrial Cardiomyocyte Sinoatrial Nodal Cell Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Smooth Muscle Cell Atrial & Left Ventricular' Cardiomyocyte Kostra - skelet chrupavka (chondrocyty) + kost (osteoblasty a osteoklasty) - vývoj končí v pubertě chondrocyty^r MESODERM klidová zóna proliferační zóna růstová zóna apopiozá ENDOTEL osifikace MSC osteoblast Runx2* -> Osx Fos, AFos, Fra-1 osteoblast (mineralizující) Osteocalcin Osteoklast ontogeneze regenerace ŕRunx2 -/-, jen chrupavka kolagen klidová zóna chondrocyty (O S 05 OJ s CC 1 tmavší = výší exprese 2 i? Ihh - Indian hedgehog PTHrP - od parathyroidniho hormonu odvozeny peptid (PTH-related peptide) Fgfr3 - receptor 3 pro FGFs Sox9 aktivuje expresi kolagenů typu II, IX, XI Sox9 -/-, nevznikají chondrocyty - velice malá schopnost regenerace - složitý vývoj, různá regulace a odlišné typy buněk mezi pronefros, mesonefros a metanefros - multipotentní buňky, kultivovatelné in vitro a integrující se v různých oblastech ledviny objeveny ve stěně renálních papil (Oliver 2004) - klíčové geny pro vznik ledvin: Iim1 (homeoboxový gen); transkripční faktory Pax2, Pax8 - geny klíčové pro regulérní vývoj ledvin: Wnt4, BMP7; transkripční faktor FoxD1, pod-1; PDFG/PDGFR ,-, Metaneptiric mesencriymal ; ii cell SSC „entodermálního" původu Játra a pankreas Embryo. X % (Endoderm) 4 i Ventrai foregut endoderm Hepatopancreatic stem cell Cňepatoblasp <^Tncreatic pr^oirsop (rtepatoc^/'^ile duct" pitheiial ceil ■.epttheHai & (Duete) cehs A cells / Během embryogenéze vznikají játra a pankreat ze společného progenitoru/kmenové buňky. Přítomnost takové buňky v dospělém organismu, však nebyly dosud prokázána. a) vlastní jaterní buňky hepatocyty (albunim), oválné buňky (vlastní jaterní kmenové buňky, c-kit, SCF, Thy1 albumin / CK19), epiteliální buňky žlučovodu (CK19), hvězdicovité buňky b) další typy buněk v játrech endotelie, krevni elementy, Kupferovy buňky, SP buňky,.. Jaterní tkáň běžně regeneruje proliferací vlastních hepatocytů (hepatotektomie), případně proliferací a diferenciací oválných buněk (otravy, požkození chemikáliemi). Jednotlivé typy buněk jsou preferovány podle typu požkození. Hlavní, proliferací indukující faktor je HGF (hepatocyte growth factor), na celkové regulaci regenerace se pak podílejí i IL-6 (interleukin 6), TNFa (tumor necrosis factor a), TGFa (transforming growth factor a), EGF (epidermal growth factor) - regenerace jater HSCs: c-kit+++, Thy+--, Lin-, Sca1+ (fenotyp KTLS) z kostní dřeně tvoří po transplantaci do jaterní tkáně, zdá se funkční hepatocyty - regenerace jater MAPCs a BMSSCs: MAPCs se usazují v játrech (chiméry i transpalntace) a i in vitro dávají vznik hepatocytů (?!). BMSSCs, se usazují v játrech, ale zdá se, že zejména fúzují s tamními hepatocyty (časté karyotypy při sex-mix transplantacích jsou XXXY a XXXXYY). Plná funkčnost těchto MAPCs a BMSSCs derivátů však zatím nebyla prokázána. Model zapojení se HSCs / hematopoetických progenitoru v regeneraci jater BohJE MARROW HSC [bona marrow] ©intrahepatic stem ceil [Canal ol Henng] OC Oval cen [poňal zore ol hepatic lobule! Hi-'.. :d !..■;.>• H Bile duel epilheltal cell B [ / /Hennatopoiesis LIVER oč - regenerace z oválných buněk nt - normální obnova jaterní tkáně pt - obnova jaterní tkáně po odstranění její části a) exokrinní buňky (trávicí enzymy) a epiteliální buňky tvořící kanálky pro odvod těchto enzymů do dvanáctníku b) endokrinní buňky a (glukagon), (3 (insulin), ô (somatostatin) a pp-buňky (pankreatický polypeptid) - prekurzor pankreatu (embryonální) exprimuje transkripční faktor „pdxl - poslední studie ukazují, že |3 buňky se neobnovují z kmenových buněk, ale svou vlastní pomalou proliferací. Exprimují insulin, Pax6, HNF3/3,.. - endokrinní buňky mají velice podobný vývojový program jako buňky neurální (NeuroD, is11, Nkx2.2, Nkx6.2,...) rozdíl je zejména v insulinu a pdxl - epiteliální buňky kanálků se sebeobnovují podobně také exokrinní buňky acinů - SCs pankreatu nebyly dosud objeveny - diferenciace BMSSCs (?) do p buněk byla jednou prokázána, ale nezopakována -buňky pankreatu mohou tvořit hepatocyty u člověka spontálně (in vivó), u potkana to lze navodit experimentálně, opačně to nefunguje, avšak exogénni exprese pdxl v hepatocytech z nich dělá buňky exprimující insulin se znaky exokrinních buněk, podobné i u buněk embryonálního epitelu střeva