Fyziologie kmenových buněk Proliferation & Differentiation Se If-renewal Jiří Pacherník E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223/116 Podpořeno FRVŠ 540/2007 KMENOVÉ BUŇKY - zdroj buněk dané tkáně / orgánu - primární buňky pro danou strukturu Schopnost - dávat vznik dalším typům buněk (schopnost diferencovat) - sebeobnovy (selfrenewal) = > kmenovost (stemness) Dělení buněk a jejich sebeobnova DbJbíjj buněk (proJiferacs) Symetricky - vznikají dvě identické buňky (^) ® Asymetricky - jedna si zachovává původní fenotyp, druhá je již jiná Diferenciační dělení obě nově vzniklé buňky mají i nový fenotym, jsou dalším stupněm v dané diferenciační lin diferenciační dělením symetrické diferenciační dělením asymetrické DVíBfBíiďm^B {fp-zfíi-zňuvíiin) buněk Buňky mění svůj fenotyp v na základě změny exprese svého genotypu v důsledku vnějších signálů. Regulace diferenciace je často provázána s proliferací (epigenetické změny v jádře během mitotického cyklu?). Pluripotent Stem Cells (^Totipotent 3 In vivo fertilized egg S cell embryo Cultured undifferentiated stem cells Neural cells Cardiac muscle Blood cells Kmenová buňka aktuální <-> potencionální Přechodně/transientně se dělící buňky (Progenitory)* Terminálne diferencovaná buňka** * Často proliferují a mají schopnost krátkodobé sebeobnovy. 7£ maturace ** Post-mitotické buňky = už se nikdy nedělí. Ne všechny terminálne diferencované buňky jsou post-mitotické. přestavba genomu / chromatinu -> exprese jiného paternu genu -> jiná morfologie, jiné funkce a potenciál Determinace - předurčení pro danou diferenciační linii / dráhu geny a jejich produkty - „houskeeping" (metabolismus, transkripce / translace, základy cytoskeletu) - všeobecně abundantní (transripce/translace, cytoskelet, komponenty signálních drah) specifické (enzymy, specifické transkripční faktory, cytoskelet - komponenty intermediálních filament, s cytoskeletem asociované proteiny) Jbasic ructure cture genotyp T— ic jructu Jb ^_^Hructure metal basic menabdMí bd fcwwjtabolipm baa)taboli|sm fenotyp basic structure basic netabolism dle skupin genu, které jsou exprimovány basic structure basic netabolism basic structure basic netabolism basic basic structure basic structure basic netabolism basic structure basic metabolisrr basic structure basic basic structure basic netabolism T basic structure basic metabolism basic structure basic netabolisr basic netabolism A hadiska ^Snovnosú ivom daJší burjščrjé ivpy se buňky dáJÍ mi; Totipotentní - mohou z nich vznikat všechny buňky daného živočišného druhu Pluripotentní - mohou dát vznik všem buňkám budoucího jedince (všechny tři zárodečné listy) Multipotentní - může z nich vznikat větší počet buněčných typů dané buněčné řady (Oligopotentní - podobné jako multipotentní, ale méně typů) Unipotentní - dávají vznik jen dvěma typům buněk Nullipotentní - mohou se pouze dělit, nemění fenotyp TaiipaianiJTJj buňky -1- až 8-buněčné embryo (= Embryonální nespecifikované - pouze savci) - Omezené možnosti dělení (neprobíhá transkripce; myš 2/4 b., člověk 8 b.) - Existují pouze přechodně 2-cell stage Ztráta totipotence v průběhu časné embryogenéze - vznik nerovnoměrných podmínek pro růst buněk - tento proces je ireverzibilní The Erophutolast will becomť part oŕ ihc pľace ni lI. http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap13/Chapter_13.html#fertilization Dělení buněk 2-buněčného embrya, určení polarity a její vliv na další osud blastomer Magdalena Zernicka-Goetz 2006 ME EM MM 4 EE * RANDOM 80% of all embryos M - meridiální / E - ekvatoriální Orientace blastomer 4-buněčného embrya a její vliv na zachování absolutní totipotence těchto buněk "ME" EMBRYO still permits CHIMERA OF A/V CELLS MERIDIONAL CHIMERA MA LV VEGETAL) regulative development CHIMERA A OR V CELLS ARREST AT PERI- DI IT --> IMFLANTATION --> Píotyowihx^hlííiche-elralí, Development2005 P\íiňpuí3nhn buňky (savci) a) In vivo: buňky vnitřní buněčné masy buňky epiblastu / primitivního ektodermu buňky nerální lišty (4tý zárodečný list) kmenové buňky teratomů (?) ! (somatické kmenové buňky?) b) In vitro: embryonální kmenové buňky embryonální zárodečné buňky embryonální nádorové buňky (kmenové buňky teratomů) ! (somatické kmenové buňky?) Morula Blastocyst Late blastocyst Egg cylinder Gastrula Ectoplacontai cone Visceral endoderm ectoderm Boiani & Scholer 2005 Kmenové buňky mohou být pluripotentní, multipotentní,... ale pluripotentní nebo multipotentní buňky nemusí být kmenové. Pleopotence (změna v determinaci) pluripotentní buňka \ multipotentní tkáňově specifická buňka Pleopotence / \ i progenitory 1 I multipotentní tkáňově specifická buňka o ^-^(Pleopotentní buňka) terminálne diferencované buňky Schopnost sebeobnovy = self-renewal Schopnost dávat vznik jiným typům buněk = pluripotence / m u Itipotence /..... = > kmenovost = stemness - Společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami, nezralý fenotyp / relativně nediferencované (= dlouhé telomery / vysoká aktivita telomeráz, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...) = VYHRAZENÉ (PROFESIONÁLNÍ) KMENOVÉ BUŇKY - Některé somatické, terminálne diferencované buňky si zachovávají schopnost sebeobnovy a v případě potřeby i multipotence, normálnejšou ale quiescentní (spící) = FAKULTATIVNÍ KMENOVÉ BUŇKY (snad některé hepatocyty a buňky plicních epitelů) - Některé diferencované buňky si také dlouhodobě zachovávají schopnost proliferace, sebeobnovování a podílejí se tak na udržení homeostáze v tkáni = Sebeobnovující se diferencované buňky - dávají vznik buňkám dané buněčné struktury / tkáně / orgánu / (organismu) - relativně pomalá proliferace - jsou nejčastěji multipotentní, snad některé i pluripotentní či unipotentní - jsou základním zdrojem buněk pro regeneraci organismu a homeostázi - mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = in vivo asymetrické dělení - s věkem jich ubývá, ale pravděpodobně nikdy během života jedince úplně nevymizí profesionálni SC - v tkáni jsou lokalizovány ve specifické oblasti, „niche" (koutek) - mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,... - ??? Somatické kmenové buňky (embryonální a adultní) Buňky některých zárodečných linií (neurální lišta, primordiální zárodečné buňky) a kmenové buňky trofoblastu KMENOVÉ BUŇKY ODVOZENÉ/SEKUNDÁRNÍ = existují jen „in vitro1 jsou připravené z populací pluripotentních embryonálních buněk, ze zárodečných buněk, nebo z progenitorů embryonálních a dospělých tkání relativně rychle proliferují některé jsou multipotentní (z embryonálních a dospělých tkání), některé pluripotentní (embryonální původ) mohou být zdrojem buněk pro regeneraci organismu mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = „asymetrické/symetrické" dělení mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,... ??? Embryonální kmenové buňky -> odvozené z vnitřní buněčné masy (Kmenové buňky epiblastu) Embryonální zárodečné buňky ■> odvozené z primordiálních zárodečných buněk Embryonální nádorové buňky -> odvozené z kmenových buněk teratomů Somatické kmenové buňky odvozené -> odvozené ze somatických kmenových buněk REGULACE KMENOVÝCH BUNĚK Existence kmenových buněk je regulována a) vnitřními (intrinsic) faktory (vývojově specifické transkripční faktory a specifické kombinace drah transdukce signálů) b) vnějšími (extrinsic) faktory (v niche) Kmenové buňky mohou existovat jen v příslušném „NICHE" Co v NICHE najdeme? růstové faktory, proteiny extracelulární matrix, povrchy buněk / buněčný kontakt, hypoxie, nedostatek živin? Podobně jako se zdají být SSCs tkáňově/orgánově specifické, jsou specifické i jejich „niche". NICHE Naveiras, 2006 b. Mouse bone marrow Cap celí » Osteoblast —f — ~Th -------NICHES------------!L)_-_-_!_- Myofibroblast J Astrocyte ^ & ô c. Moose small intestine d. /Mouse sjbventricular and subgrarutar zone a C. elegans (one-cell stage] b £>. meianogaster (neuroblast) Apical G MC _ PAR- 3/PA R- 6/ P KC- 3 PAR-2, PAR-1 — LIN-5/Ga ■ ■ ■ GPR-1/2 • PIE-1 — Microtubules DNA - PARS/PARů/aP KC - Mud/Pi ns-Loco/G,,, - Mira. Pon Brat. Numb. Prospero - Microtubules DMA c D- metanogaster (SOP) Anterior Posterior pi lb \^ plla — PAR3/PAR6/aPKC — Mud/Pins-Loco/Grri — Pon O \ui b. Nejrdl ..wj 4% Recycling endosome — Microtubules «3> DNA Apical Basal Polarity Apical Příklady mechanismů regulujících symetrii buněčného dělení na modelových orgaismech NB - neuroblast SOP - sensory organ progenitor (Jan & Jan 2000; Robert Andrews & Julie Ahringer 2007) Planar Polarity Apical Q^J N B hrj GMC Post. Ant. Basal NB Basal SOP Polarized Gpithelium Delaminating neuroblast Metaphase neuroblast Bazooka Inscuteable Pins Numb/Prospero Úloha (trimerických) G-proteinů v regulaci polohy dělícího vřeténka Horizontální orientace vřeténka Náhodná orientace mitotického vřeténka u buněk s inhfoovanými Gpy Symetricky dělící se buňka Asymetricky dělící se buňka Symetricky dělící se buňka ™ Pocfoet laterální polarity Proteiny určující neurální osud buňky Gpy v komplexu s Got W Volný Gpy íf Inaktivovaný volný Gf3y jsaj 2005 Signální dráha LIF (leukémii inhibující faktor) -> gp130 signalling _^»self-renewal _ Evolučně se zdá, že tato dráha hraje důležitou úlohu v regulaci pluripotentních a snad i multipotentních buněk u živočichů obecně (prokázáno i u Drosophilý) Význam gp130 signalizace v průběhu embryogenéze Signální dráha FGFs (Fibroblastové růstové faktory) Signální dráha TGFp / BMPs (Transformující růstový (growth) faktor (3 kostní (bone) morfogenetické proteiny) Type 1 Type II ►(R-Smad/v Smad4 Cytoplasm l-Smad Smad4 Nucleus 1 CROSSTALK FGF & TGF0 DRÁHY TRANSDUKCE SIGNÁLU Potlačení sérového BMP přidaným FGF-2 => inhibice diferenciace hES FGF, IGF EGF, HGF > Ras >MEK1 MH1 1 inker Srn ad 1 i Erk1,2 Other kinases BMP receptor MH2 W ¥ ® MH1 Smad2 NucJear import Epidermal d Mesoderm ventralization fferentiation Massague, 2003 TGFß, Nodal. Activin receptors MHZ (B Nuclear import Mesoderm induction 98 Signální dráha Hedgehog sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) Ptc - Patched Smo - Smoothened DSL Signální dráha Notch b) genes - a) klasická dráha signální transdukce Notch, po navázání Ugandu (DSL rodina = Delta, Serrate, Lag-2; Jagged) dojde k odštěpení extracelulární části receptoru a následně i intracelulární (NICD - Notch intacellular domain), ta translokuje do jádra a v dimeru s CSL (= CBF1 - Cp binding factor 1) aktivuje transkripci. b) dráha snad aktivovaná dosud neznámým faktorem, kdy dochází k aktivaci proteinu Deltax, který pak inhibuje JNK a CBP/p300 aktivitu. Kadheriny sprostredkovaná komunikace mezi buňkami Phosphorylation sites site Calcium-bimJing site Cíli rm1 rub ran c Calcnin& Integriny zprostředkovaná transdukce signálu Ir (>•'_]( r Signální dráha jaderných receptoru obecně cell membráne Boghog 2; Wikipedia Signální dráha jaderných receptoru and ® ( N R ) jaderné (nuclear) receptory transkripční faktory TF TF ( N R I N R ) transkripce transkripce DNA\ sebeobnova x diferenciace ?differenciace x sebeobnova? HYPOXIE GROWTH FACTOR * CYTOKINES (PDOF. TOF0, ILIMNFö. il5,il8.il1u| 5UFPRE5-"SOH GENES ONCOGENES (rtiL Hai.(i1tJ l(nas, r*1, he HERZerbB -ftHtflJ [VEGF [ HEO*HQIQQEME3IB PERITUHOH^L INFLAMMATORY HE*CTIC*t ^ TUMOR SLCOD FLOW AMAEROBtC In this figure the structural and functional effects of Hypoxia, HIF-1 and VEGF on tumor microcirculation, cancer metabolism and therapies are illustrated. The vicious circles that occur are also shown. (Modified with permission from: Baronzio et al. Anticancer Res 1994; 14:1145-1154.) I PCM 4 NUTRIENTS I DRUGS £ «WJKCELLEI MNCiNTnATlON *. FtAMG RESISTANCE ILO0P ST,i3*sH UT!i;Crai|T*HJB.LLÖD CELLS AÜMEQ^TlOH HYPOXIE <& HIF (hypoxií indukovaný faktor) a Normoxia Cell proliferation and survival HIF-1a regulation by proline hydroxylation Expert Reviews in Molecular Medicine 5005 Published by Cambridge University Press HYPEROXIE x NORMOXIE x HYPOXIE x ANOXIE anoxie - 0% kyslíku tkáňová hypoxie - 0-3% kyslíku tkáňová normoxie - 3-5% kyslíku atmosféra - 21% kyslíku In the human organisms, 02 concentration varies significantly between the tissues: in the lung parenchyma and in circulation (McKinley and Butler, 1999; Saltzman et al., 2003; Johnson et al., 2005; Wild et al., 2005), as well as in well irrigated parenchymal organs (liver, kidneys, heart; Wo" Ifle and Jungermann, 1985; Jungermann and Kietzmann, 1997; Roy et al., 2000; Welch et al., 2001; Mik et al., 2004) it is comprised between 14% and 4%. In other tissues, relatively less irrigated, 02 concentration is even lower: in the brain, it varies from 0.5% to 7% (Whalen et al., 1970; Nwaigwe et al., 2000; Hemphill et al., 2005) in the eye (retina, corpus vitreous), from 1 to 5% (Buerk et al., 1993; reviewed in Yu and Cringle, 2005), in the bone marrow, from 0% to 4% (Tondevold et al., 1979; Chow et al., 2000).