Pluripotentní, odvozené kmenové buňky Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell - ESC) Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cell - EGC) Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cell - ECC) Kmenové buňky epiblastu (Epiblast stem cell - EpiSC) Early-primitive ectoderm-like - EPL Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell) Inner cell mass Blastocyst _ cavity Trophoblast Diameter = 0.1 to (O millimeters (0.0039 tú 0.0079 inches) Illustration by Cell Imaging Core of the Center for Reproductive Sciences, -jsou odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty - fenotypem odpovídají přibližně buňkám vnitřní buněčné masy (mESC, ICM - inner cell mass) nebo epiblastu (hESC, EpiSC) -jsou pluripotentní - přirozeně neexistují, pouze in vitro - jsou nesmrtelné - mají schopnost si udržet stabilní genotyp (!?) - po injikaci do imunitně tolerantního organismu tvoří teratomy (důkaz pluripotence) - po injikaci do blastocysty mají schopnost tvořit kompletní chiméry (známo jen u mESC, důkaz pluripotence) Ontogeneze a diferenciační potenciál buněk vnitřní buněčné masy r Ep i b last Vnitřní buněčná masa Blastocysts ■>- Hypoblast Embryonální tkáně Zárodečný ektoderm Zárodečný epiblast Zárodečný mezoderm Primitivní proužek Alantoický ektoderm Zárodečný entoderm Extraembryonál ní entoderm Žloutkový vak Trofoblast Cytotrofoblast Syncytiotrofoblast Extraembryonální tkáně Gilbert 1997 / Bílek 2004 1 6-8 ddnů IVF 3,5 dní p.c. Izolace myších ES buněk +j* 4-5 dní Imuno-chirurgie ICM Vyseknutí a disociace ICM Fibroblastová výživná vrstva „feeder"- tvořená MEF Odstranění PEF Linie ES buněk na feederu MEF Upraveno podle Kroupová 2004 Nádor, který obsahuje buňky více jak jednoho zárodečného listu, většinou všech tří. Tyto buňky mohou být fenotypu od časných stádií až po terminálne diferencované Teratomy jsou typické nádory původem ze zárodečných buněk (ovariální a testikulární teratomy. Teratomy jsou jak benigní, tak maligní (teratokarcinom) Kmenové buňky teratokarcinomu = embryonální nádoro (Embryonal carcinoma (EC) cells) /é buňky CHIMÉRA Organismus je směsí geneticky odlišných buněk / tkání / orgánů Chiméričtí jedinci vzniklí injikací ES buněk (dárce) do blastocysty (příjemce) jsou směsí geneticky odlišných buněk na úrovni všech tkání, a tak také vytváří pohlavní buňky s genotypem jak dárce, tak příjemce! Růst a kultivace ES buněk PROLIFERACE - DIFERENCIACE - APOTÓSA Existence a charakter ES buněk je udržován kombinací účinků vnějších (extrinsic) a vnitřních (intrinsic) faktorů. Vnější faktory si ES buňky částečně syntetizují samy, ale ve větší míře musí být dodávány. Významným zdrojem těchto faktorů je výživná vrstva na které se ES buňky kultivují = FEEDER. Vnitřní faktory si ES buňky nesou jako pozůstatek svého embryonálního původu. FEEDER výživná vrstva = zdroj růstových faktorů (cytokiny, ECM, ..) a vhodný podklad nejčastěji se používají myší embryonální fibroblasty (13d p.c, MEF (PEF)) bez „feederu" z MEF = definované podmínky, ale horší ES buňky tendence používat druhově identické MEF = sníženi rizika přenosu virů, ... MEF lze nahradit i jinými typy fibroblastů případně jinými buňkami MEF lze částečně nahradit komponenty ECM, specifickými cytokiny a přídavky, matrigelem,..., obecně definovanějšími preparáty Důležitou komponentou kultivačního média pro ES jsou také nedefinované faktory séra, které lze nahradit dodáváním specifických růstových faktorů. Často se také používá tzv. Serum-replacement = lépe definovaná náhražka séra (patentované složení). ES buňky spontáně diferencují, v kultuře je třeba této diferenciaci zabránit diferenciace je často spojena s apoptózou vhodnými kultivačními podmínkami, lze diferenciaci inhibovat faktory inhibující diferenciaci ES buněk se částečně liší u různých druhů, ale existují výjimky i v rámci jednoho druhu! mezoderm + entoderm auto- a parakrinně působící factory ektoderm Model inhibice diferenciace myších ES buněk IGF, FGF-4, Wnt mezoderm + entoderm ektoderm Feeder - existují i linie mES buněk nezávislé na LIF - zdá se, že z LIF závislé linie, lze vyselektovat LIF nezávislou (!?) - mES buňky pěstované bez „feederu" ztrácí schopnost tvořit chiméry in vivo - některé linie nelze bez „feederu" pěstovat vůbec - vlastnosti mES buněk jsou ovlivněny genotypem imbredního kmene myší z kterého byly izolovány! LIF - leukemia inhibitory factor BMP-2,4,12 bone morphogenetic protein 2,4,12 FCS - fetal calf serum FGF-4 - fibroblast growth factor SR - serum replacement ^absolutní optimum MEF (feeder) nebo matrigel FCS - obsahuje jak difereciaci indukující, tak diferenciaci inhibující faktory. Kvalitu FCS také ovlivňuje titr protilátek a složek koplementu. FCS se liší mezi jednotlivými šaržemi = je třeba je testovat. Lépe je používat náhrady FCS se sníženou koncentrací negativně působících látek na kultivaci ES buněk, např. Serum-Replacement (fy. Invitrogene-Gibco) OPTIMUM??? Základní vnitřní faktory charakterizující / regulující ES buňky (pluripotentní embryonální buňky) Oct-4 (Oct-3/4, Oct-3, Pou5f1 - master of pluripotency) - transkripční faktor, homeoprotein - exprimuje se již u 2/4 (myš - aktivace transkripce) buněčného embrya - ve stádiu blastuly je jeho exprese výrazně zvýšena - ve stádiu blastocysty je pouze v buňkách ICM - později jeho exprese vymizí, zachovává se pouze v PGC (a později v zárodečných buňkách), nízká exprese se předpokládá i v somatických kmenových buňkách ?!? - nebyl nalezen u kuřat - reguluje expresi FGF-4 (Oct-4/Sox-2), PDGFa, .... - v průběhu diferenciace za snížení jeho exprese odpovídá GCNF( germ cell nuclear factor, RA (retinoic acid),... - v primitivním ektodermu je exprese Oct-4 podporována LRH-1 (liver receptor homologue 1) - speciální varianta vzniklá alternativním sestřihem, se ale exprimuje u MO Integrln Boiani & Scholer 2005 Potencionální mechanismus účinků LIF u mES buněk LIF/gp130/LIFR Jak2/STAT3 PI3K/Akt + Erk Klf4 A I Sox2 A Oct4 Tbx3 A I Nanog {} Niwa 2009 Alternativní kultivace mES protocol 2Í/LIF, 3i/LIF (A. Smith laboratory) ERK p3& MAPK Endoderm Mesoderm Neural cells Idl and Id3 BMP FGF4 SU 5402 PD184352 -\ MEK i GSK3K ERK FGF4 PD0325901 CHIR9902 a) standard protocol b) 3Í/LIF protocol c) 2Í/LIF protocol LIF (indukce STAT3) SU5402 (inhibice FGF-R) PD0325901 /PD184352 (inhibice Erk signalizace) CHIR99021 (inhibice GSK3, Wnt signal Regulace transkripce faktory Oct-4, Nanog a Sox-2 Předpokládaný model vzájemné regulace exprese FoxD3, Nanog a Oct-4 u mES. FOxD3 není exprimován u hES. Vzájemná regulace Oct-4 a Nanog není dosud plně objasněna. Je však již jasné, že Oct-4 řídí transkripci Nanog přímou vazbou v jeho promotoru (společně se Sox-2), jak u mES tak hES. Pro self-renewal ES buněk je klíčové zachovat rovnováhu v hladinách Oct-4 a Nanog (viz. výše). Promotorové sekvence rozpoznávané Oct-4, Nanog a Sox-2 u hES. Model vzájemné regulace Oct-4, Nanog a Sox-2 a některé jimi řízené geny u hES. Proteiny Promotory genů Boyer2005 i ,.fcQ.::(:J ro*03 ©N L Ľ k I - tJ'-'Az I ■p ■ I jrp. íhraialnftcmHlcIrg HM.r-H AsŕljHlnin Helnrr: Vf differentiation "Ii;lorrieras& and Mtrnionmlily fwnes Rb and cell cycle Inhibition of positional genes (Hox) Některé charakteristické znaky myších a lidských ES buněk Aikalin^-Phosphatase SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 TRA-1-60 TRA-1-81 OCT 3/4 SOX 2 REX 1 TERT FGF4 UTF-1 FOXD3 CX45 CX43 BCRP-1 LIFR gpl30 STAT3 Nanog Mouse ES + + + + + + + + + + + + + + + Human ES + + + + + + + + + + + + © + + + Table 1 I The best-characterized ESC markers* Undifferentiated state marker Mouse Human Cell-surface and nuclear antigens SSEA14 + - SSEA3/4* - + TRA1-6G/B1& - + TRA2-54 - + GCTM-2* - + TG343S ? + TG3ÖI ? + CDS* + + CD133/prominin + + 0CT4 + + NAN OG + + SOX2 + + Enzymatic activities AP + + Telomerase + + In vitro culture requirements Feeder-cell dependent + + LIF dependent + - FGF4 + - Growth characteristics Ability to form trophoblast - + Teratoma formation in vivo + + Growth characteristics in vitro Form tight, rounded, multi-layer clumps; can form EBs Form flatf loose aggregates; can form EBs Ability to form germ cells in vitro + NR *Glykolipidy, § Keratan chondroitin sulfát proteoglycan, 'Tetraspannin transmembránové proteiny, AP - alkalická fosfatáza, EB - embryoidní tělísko, ESC - embryonální kmenové buňky, SSEA - vývojově specifický embryonální antigen (stage-specific embryonic antigen), TRA - antigen odmítnutí nádoru (tumor-rejection antigen), NR - nestudováno (not reported) Signälni dräha TGFbeta / BMPs u ES bunek Liaand Type II R Type IR R-Smad BMP TGFß Activin TGFpR-ll ActR-ll Nodal /CH ActR-IIB Cripto (TDGF1) BMPR-II ALK2 ActR-ll ALK3 ActR-IIB ALK6 ALK1 ALKS ALK4 (smaen) (sma^is) SmadS / T I-Smad ^3mad2j (^Smad^ + mES - hES / mEpiSC Nucleus - mES + hES / mEpiSC ESCs EpiSCs t t Inner cell mass Trophoblast Blastocyst cavity Extraembryonic ectoderm Epiblast EpiSCs Blastocyst Egg cylinder Germ cells Kmenove buhky epiblastu - EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 object Data gene expression rnESC Mouse EpISC Dppa3fStetta^ Tbx3& Nrtbl/Daxlw Piwil2 m PecamT ř Gbx2 Zfp42 KM Sox2 Cdkl fE^adherin Gdf3 Nanog Tdgfl Myc Nodaí Acvr2b Gat CtdnG 0tx2 Leftyl Pitx2 Acta2 Lefty2 Foxa2 Eomes Dkkl Gataß Sort 7 Cerf rnESC rnESC and EpISC Mouse EpISC o o O 7~ D O O N orma lized exp re s s i on intens ity Kmenové buňky epiblastu - EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesař, 2007 a 2.5 £.0 .Q 1.5 1.0 jí 0.5 0.0' □ mESCsflf p14 □ mESCs CGR8 p£5 □ mEpiSCs BS.10a p38 □ mEpiSCs N0D21 p26 i .1 Jo 0 H T Oct-4 Nanog Sox2 Flexi FGF5 Nöda/ PotiSfl Zfp42 c Global gene expression correlation 0.971 EpiSC no. 1 0.385 EpiSC no. 2 0.784 0.974 mESC no. 1 mESC no. 2 Oct3/4 enhancer activity mESC mES je možno reverzibilně převést na buňky připomínající buňky primitivního ektodermu tzv. EPL (early-primitive ectoderm-like) buňky. Tyto buňky již nemají podobně jako buňky primitivního ektodrmu schopnost tvořit buňky parietálního entodermu. Také některé jejich další schopnosti diferencovat, jsou oproti ES buňkám pozměněny (Peiton 2002). Meshorer & Misteli 2 Modifikace histonů - regulace transkripce SUMOylation AcetylatJon Methylation \ / Core histone t Ubiquitmation Phosphorylation ;cql_ a * •to H2N- ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVK H3 12 3 4 S S ID 11 14 17 18 _A_A_A__A • W H2N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK 23 26271 35 H4 1 3 5 S 12 16 18 20 A Acetylaiian ft Methylation l^ft Phosphorylation - o DNA mod ifications Histon e modif i cations V Meihy(3ied CpG A H3K9ac # H3K9m3 Unmethytatřd CpG O H3K4m3 ft H3K27m3 ESCs MSCs DIFF oř A ? K4nW ^ K27m3 His1r,ntH3 pK* _^ K4m3 K**° TT. on Hislpne H? |—í B Pnuim j foí PcG (* PcG ON f P* Priming lor ON Profil postranslačních modifikací (lysinových zbytků) histonů H3 a H4 u ES (J1, V6.5), EC a MEF buněk 0113 k, ; gttO-í 1 MÍKSat JI tf.) EC MBP H3KŮaoK14ac Ji V6ř EC MEř 0 J1 EC H3K27meJ 14 18 23 79 A H3 H3KSrt1*1 r: Ji 1:: f\ U6.5 EjQ mef H3KSm»2 vil: JI Wí ec mef H3K9m*3 ji ve.s ec U=f db_H3K4mM_ i_ 1 °*__1 " 11 b JUfl "1 * JI VfS ec mef H3K4m»2 JJ Ve.i ec mef 0 H3K4me3 H3K73me2 -r- rfl I ji v£i fit 12 20 B H4 C macroH2A jh ub.s H4K20me3 ! Ji US 5 -C HEF macnaH2A JI J1-RA MEF Dai & Rasmussen 2007 Model změn trankripčního profilu v průběhu indukce diferenciace ES buněk a HA model b ETCM model c PT model Sternness genes Lineage I genes Lineage II genes Housekeeping genes Repeats Sternness genes Lineage I genes Lineage II genes Housekeeping genes Repeats ChOHCH[>DCH£> -D€>Df>DC>Ě> i>D-0-ChOC>D-■DŮ£hDChDí> CHJ€>C>OCHL> C>ChCHIH>OC> ChO€3-ChD-DO HA - model postupné (hierarchické) aktivace (hierarchical activation) -> metylace DNA ETCM - model povolené/umožněné transkripce (early transcription competence marks) -> modifikace histonů PT - model promiskuitní transkripce (promiscuous transcription) -> kombinace transkripčních faktorů a transdukce signálu Meshorer & Misteli 2006 Profil metylace DNA u rüznych typü bunek (40 genü, 49 CpG mist) rrm 11 rfl 11 iTiTTiTiilTi rrTTT^rr??! n 111111 n 11 — C"^/l-*Li" im J- IS —tiya WTT TrrmrrT Lc-i r±, lXi_v lXO. co. ü-d. iitfl : -T ■ j: ■-■ ■—• 'T" ■r-H.j:. 60%, hES > 50%) doubling time mES - 10-12h, hES - 18-20h specifická charakteristika regulace buněčného cyklu (odolnost k p16, nízká hladina cyklinů D, vysoká hladina cyklinu E, není potřeba proteinů rodiny Rb) inhibice proliferace, prodloužení G1 fáze (suboptimální podmínky) vede k diferenciaci a apoptóse, diferenciace a apoptósa ES buněk, však nemusí vést ke snížení proliferace jako takové tzv. kontrolní bod R, o průchodu tímto bodem rozhodují zejména mechanismy rozpoznávající itegritu/neporušenost genomu, buňky s požkozenou DNA jsou za normálních okolností v tomto bodě zastaveny. Porucha tohoto kontrolního mechanismu je typická pro nádorové buňky. Rozdílné proporce v jednotlivých fázích cyklu u časných embryonálních buněk From The Art of MBoC^ © 1995 Garland Publishing, lnc| Model narůstající heterogenity v rostoucí kolonii ES buněk za dodržení známých optimálních kultivačních podmínek Myší ES 30<* 50<* růst kolonie ES buněk Lidské ES Časného neuroektodermu Buňky primitivního entodermu (morphologicky navíc tvoří také malá granula) 'orientační počet buněk v kolonii vývoj blastocysty trofoectoderm Variabilita v analýze transkripčního profilu u ES buněk (ESC), neurálních progenitorů (NPC), Existují geny kmenovosti, tzv. „stemness geny" ? Vývojově specifické geny => potenciál buněk Příslušné signální dráhy, specifický patern jejich aktivit => regulace diferenciace, proliferace, sebeobnovy Chromosomální stabilita a ES buňky Draper, 2004; Hanson, 2005 - dlouhodobá kultivace ES buněk vede k selekci odolnejších klonů a subpopulací - menší responzivnost na vnější signály, rychlejší proliferace, menší nároky na kultivaci, klíčové znaky často zachovány (Oct-4, Nanog, příslušné SSEA,...) - u myší snížena schopnost tvorby chimér a zejména germline u těchto chimér - často spojeno s genetickou manipulací (knock-out, -in ES linie) - nestabilita chromosómů, polyploidie, trizomie, zlomy a přeskupování genů => adaptace na in vitro podmínky - hES, primární je trizomie chromozomu 12 nebo 17, vzácněji chromosomu 14 a 20 - často dochází i ke zdvojení dlouhého raménka chromosomu 17 a k translokaci této kopie na dlouhé raménko chromosomu 6 => posílení exprese genů na chromosomu 17 (Survivin - proti apoptóse, STAT3 - self-renewal mES a nadbytek u většiny nádorů, GRB2 a 7 (growth factor receptor bound protein, viz. signální transdukce)) - na chromosomu 12 je lokalizován nanog (Nanog) - časté i změny malých oblastí na chromosomech 1, 8,18 a 20 - u mES se jedná o změny zejména chromosomu 8 a 11 (myší chromosom 11 je z části ekvivalentní k lidskému chromosomu 17) Apoptická kontrola nestability karyotypu a ES buňky Checkpoint-apoptosis.... of karyotipic instability. Mantel, 2007 u zdravých somatických buněk při poruchách mitotického aparátu během jejich dělení a tak vznikající chyby v mitóse vedou k jejich přechodu do senescentního stavu nebo k indukci apoptósy ES buňky mají zvýšenou toleranci k poruchám mitózy, menší citlivost tzv. SAC (SAC - splindle assembly checkpoint) :> akumulace aneuploidních a polyploidních buněk v populaci indukcí diferenciace lze tyto buňky částečně eliminovat (apoptósa) tetraploidní buňky (blastomery) mohou tvořit jen trofoblast => G1 MTA/tetraploidity checkpoint => využití při tvorbě embryí plně ES původu CONTROL MOCODAZOLE PACLITAXEi. 2N m BN DNA NOC treated Příklad nárůstu apoptósy s diferenciací a požkozeným mitotickým aparátem ES - embryonální kmenové buňky EB - ES diferencovanou formou embryoidních tělísek Noc/NOC - nocodazol PAC - paclitaxel 1. Biologický a biomedicínský výzkum - Příprava geneticky modifikovaných organismů - Studium mechanismů časné embryogenéze / diferenciace Studium mechanismů kancerogeneze Studium embryotoxicity Testování farmak 2. Lékařství - Buněčné a tkáňové terapie - Příprava biologicky aktivních preparátů - Nosiče biologicky aktivních látek (pathotaxe) Príprava geneticky modifikovaných organismů - GMO Pro vytvoření linie GMO je potřeba, aby požadovaná genetická modifikace byly obsažena i v pohlavních buňkách. Tuto modifikaci je tedy potřeba provést na buňkách toti- nebo pluripotentních. Náhodným nebo cíleným(?) vložením požadované DNA do zygoty • Náhodným nebo cíleným vložením požadované DNA do ES buněk Díky prakticky neomezené možnosti kultivace ES buněk, lze mít prováděnou genetickou modifikace plně pod kontrolou, a také ji můžeme velice přesně naplánovat!!! ES buňky jsou pluripotentní, po zpětné injikaci do blastocysty a vložení této blastocysty do dělohy pseudo-pregnantní myši, blastocysta pokračuje ve vývoji a vzniklý jedinec je chimérou buněk původní ICM a injikovanvch ES na úrovni všech tkání, tedy i zárodečné. ES buňky v buněčné terapii SCNT £ E9S 1 (Nutleus removed) Nucleus from s—\ patient cell (•_) Fertilized egg Morula Blastocyst Transplant back to patient Sperm In vitro fertilization s o O zed V. o Fertilized egg Remove inner cell mass I Pluripotent stem cells Skin cell ,a ftncrealk tell Nerve (Ell V_,_J J Illustration by Cell Imaging Core of the Center for Reproductive Sciences. Morula Blastocyst R e mo ve i nner tell masi ■+■ L. * 3 i Pluripotent stem cells i Ski« cell a PaňífMticeeii Nerve cell V._,_J J Transplant to patient by Cell Imaging Core of the Center for Reproductive Sciences, a) In vivo - teratomy: injikace suspenze ES buněk do vaskularizované tkáně imunitně tolerantního zvířete, popřípadě do zvířete s farmakologicky potlačenou imunitní odpovědí - chiméry: injikace ES buněk do blastocysty, navrácení takové blastocysty do pseudo-pregnantní myši = vznik chimérického jedince b) In vitro - metodiky korespondující s ontogenezí - metodiky získané empiricky (kopírující ontogenezi?) Musí buňka diferencující z ES buňky vždy kopírovat ontogenezi aby dosáhla určitého stavu? In vitro diferenciace ES buněk kultivace indukce selekce r^S o Embryoidní tělíska (Embryoid bodies -EB) +jednoduché, více buněčných typů + tolerující genotyp - špatně definované podmínky V monovrstvě + dobře defínovné podmínky - malá výtěžnost - silně závislé na genotypu . 1CM - prfemtttvmi Y ťkjtodtnti J ^^^^^^ / Prtiúmiu \ ( ) V / TnhHml Rathjen 1998 / Bílek 2004 Epidermal celíš Keratin 14 Neurectoderm N-CAM, Matin Motor neurons Mesoderm ZGscPtodatFgfS.AOti Endothelial Cells fílcl, PECAM, Vt-cadherin Mural cell; Smooth muscle actir Endothelial and Hematopoietic Cells rik\ TW7.CD34, Catal Pancreatic celts hepacelh ^Hepatic cells Loebel, 2003 Příklady diferenciace myších ES buněk kombinací typu jejich kultivace a specifických růstových faktorů s porovnáním úlohy těchto faktorů v myší ontogenezi □ □ Zygote j Totipotent 1 Morula ' ICH 1 ESCs Blastocyst K J Pluripotent Eotcilerm Mesoderm Endoderm 6- -3 ^ li ii it 11 11 1 1 /rrvfvu Multpotent Progenitors Tissues and organs Embryoid bodies FQF2 PQF2. FQF2 -p. EGF. PDGF B M P4 or escort) ate -+ RA, c±>CAMP -► M-CSF, IL3. IL1 -*■ c-Křt. EPO -*■ RA Insulin, T3 Oligodendrocytes astrocytes Skin Smooth muscle Macrophage Erythrocytes Adipocytes Ectoderm Mesoderm Endoderm In vitro Cell type GABAergic neurons Glial precursors Dopamine igic neurons Gardiomyocytes Hematopoietic precursors Hepatocytes Undifferentiated ESCs Transplantation into Rodent model Striatum of rat model for Huntington dissase™ Brain of myelin-deficient rat (Pelizaeus-Merzbacher disease Jf Striatum of net model for Parkinson disease1 Myocerdium of dystrophic mce* Irradiated mice: myeloid end lymphoid sngraftment™ CCI4 intraiceted liwer damage mice" Myocerdium of infercted rats'1 Gu3SCh 2005 Příklad účinků jednotlivých specifických růstových faktorů na indukci diferenciace u lidských ES buněk v kombinaci s tvorbou embryoidních tělísek NGF HGF HB EB Liver ßf endoderm Pancreas liver Muscle Chondrocytes ectoderm Brain MESODERM Pancreas ENDODERM ECTODERM ^ Brain Skin MESODERM IDorsal Latent Heart k Blood Intermediate A Kidney Mullerian duct Muscle Chondrocytes ■ Dorsal Lateral ^ EGF EB Skin ECTODERM ^ Brain MESODERM Muscle /J\ Heart ^Dorsal Lateral^Blood Intermediate í Kidney BMP-4 EB ECTODERM Skin MESODERM / \ Dorsal Lateral Clioiidrocyies Blood FGF EB ECTODERM MESODERM Muscle / \ \ Heart Dorsal Lateral ** Intermediate Skin Brain Kidney TGFß EB ectoderm - *■ Brain MESODERM / \ Muscle ^ * * Heart Dorsal Lateral Intermediate \ Mullerian duel Heart Blood RA EB Skin ECTODERM íj- B rain Adrenal Muscle MESODERM / \ Dorsal Lateral Heart Activin-A Muscle EB I SODE / \ MESODERM Heart Dorsal Lateral Schuldiner, 2000 Příklad difernciace ES buněk do různých typů neurálních buněk NSC - neural stem cell, DA/Ser/GABA - dopaminergní/serotonergní/gabanergní neurony, MN - motoneurony NSC 0 2 ■ 4 - c v 0 1 8 S 10 i-: D 16 ■ 18 -20 - SRM N24bFGF t 00 Astro SRM NZ+hFGF 4ECF N2 + hFGF EGF+CHTF H2 + CM1F Oligo SRM N2 f bFGF + EGF i. H2 * bFGF EGF+PDGF N2 + PDGF N2 DA Ser GABA MN SRM SRM SRM SRM I I I .1. —J.---------------Í.........-------1------- SRM+SHH SRM+fGFB SRM4FGF4 N2 * bFGF +RA + SHH +SHH . * i * N2 + bFGF N2 4 bFGF ý H2 4 bFGF + SHH 4 FGF8 4SHH + FGF3 M2 + bFGF +SHH _i_______________i....... +™f ™.__________L... N2+AA N24AA N2*MT4 N2 4AA 4BDMF 4 BDNF 4BDNF +BDNF Barberi 2003 Model regenerace poškozené hematopoesy v důsledku Rag2-/- mutace s použitím ES buněk, genetických manipulací a jaderného reprográmování Expand HSC culture and transplant Differentiate tt^t into EBs <3^t$& Repair of Rag2~! ESCs by homologous recombination Rag2~!~ ESCs Cultured blastocyst Culture from tail cells Nuclear transfer into enucleated oocyte Cultured 4-cell embryo Replacement with somatic cell genome Removal of oocyte genome Mature oocyte Rideout, 2002 SOUČASNÉ PROBLÉMY S VYUŽITÍM ES BUNĚK V TERAPII hES se nedaří dlouhodobě kultivovat beze změn v genotypu / fenotypu dlouhodobá kultivace za sub-optimálních podmínek vede k dosud neznámým, epigenetickým změnám snižujícím schopnost pluripotence (ireverzibilními i pro cytoplasmu zygoty, Amano2oo6) dosud není spolehlivě vyřešen potencionální vznik teratomů biologie a diferenciační potenciál ES buněk nejsou dosud dobře prozkoumány kultivace ES buněk je stále závislá na nedefinovaných faktorech etika získávání nových lidských ES linií finance, přes velice atraktivní potenciál, který v sobě ES buňky mají, není jisté, jestli současná společnost bude mít dost prostředků na jejich využití např. v buněčné terapii Primordiální zárodečné buňky - PGC (primordial germ cell) PGC se u myši objevují již 6 dpc, pravděpodobně je jejich vznik indukovaný v průběhu gastrulace, a to vnějšími signály, zejména BMP (na rozdíl od žab, Drosophily a C. elegans). 6 - 7.5 dpc migrují vně vlastní embryo, později (8.5 dpc <) migrují podél zadního střeva embrya do vytvořené zárodečné lišty. PGC zanikají po usazení v zárodečné liště (10-13 dpc u myši), stávají se z nich zárodečné buňky. Prodělají ještě 2-3 mitózy a u samců vznikají prospermatogonie zastavené v G0/G1 fázi mitózy. U samic vstupují do meiotické profáze (obojí > 12.5 dpc). Podobně jako ICM a ES buňky mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy (ale TNAP ne GCAP/TNAP), Oct4, Nanog,.. Významné jsou zdá se zejména Stella a Fragilis. PGC nejsou pluripotentní! PGC mají omezený počet dělení, u myši napočítáno kolem 1000 buněk, rozdíly v závislosti na imbrední Mni Stella Také u buněk ES a epiblastu, později jen u PGC, podílí se na udržení jejich fenotypu, po jejich usazení v zárodečné liště jeho exprese vymizí. Fragilis Z rodiny IFN indukovaných genů, je silně exprimován při formování PGC, s jejich migrací jeho exprese klesá. Cyklus zárodečných buněk u myši ORGANOGENESE i primitive streak E7.5 Embryo Chorio Amnion 0 Exprese Fragiiis mezi 6-7 dpc Exprese Oct-4 v PGC usazených v zárodečné liště Mechanismus vzniku PGC -E5. ExE. VE. í LI DVE Proximal epiblast Proximal epibiast BMP4/8b E5.5-E6.0 E6.25-E6.5 AVE Eö. 75-E7 E7.25-E7.5 AVE P PGC precursors PGCs Competence Fragiiis PGC precursors Blimpl Fragiiis Somatic cells L. li -\t*jtUL' 9 PGCs Stella Blimpl Fragiüs Hayashi, 2007 E7.25-E7.5 £5.5-6.0 £3.5 Oct4 Sox2 Nanog + + + + Blimpl - - Steiia + - Fmgilis + Nanos3 - - Dnd -? -? Daz! +? -? Mvh - - Hoxal Hoxbl T +/- The expression depends on cells, regions or tissues ? Data are p rel I m i nary £10.5- H3K4me2/3 +++ + H3K9me2 + I +++ H3K27me3 ++ + + 5meC + +++ A Precursor PGCs Allocation Specification Migration Gen íta Í ridge Arginine Methyl ation?? ^Blimpl ) (PrmtS??) Cytopimem Nucleus X Birmpl ) /L Bllmpi ) / CPrmts?^ / ( Prmt5 ) [ H2/4R3me2s?? 1 H2/4R3me2s *- N Hoxbl/a1 V| Dhx38 1 Dhx38 _k E6.25- £7.25- E8.S- E12.S- f B +LIF +SCF +DFGF PGCs Cy'.optosm Nucleus EG cells (PrmtST?) \ Ai gin in e Methylation?? Blimpl ; C PrmtS ) H2/4R3me2s Dhx38 DI1X38 Blimpl - represor transkripce; Prmt5 - metyltransferáza Hayashi, 2007 Embryonální zárodečné buňky - EGC (Embryonic germ cells) - EGC jsou odvozeny z primordiálnich zárodečných buněk (PGC - primordial germ cell). - Podobně jako ES buňky je lze expandovat in vitro, a jsou pluripotentní, jak dokazuje jejich schopnost diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů jak in vitro (EB), tak in vivo (chiméry a teratomy). - Z epigenetického pohledu (DNA metylace) jsou však více podobné PGC než ES buňkám - Rozdíly v metylaci DNA se týkají zejména imprintovaných genů v závislosti na pohlaví, u EGC izolovaných z pozdějších embryonálních stádií se tento rozdíl zmenšuje. Tyto „imprinting-free" PGC, však již netvoří zdravé chimérické jedince. - U myší lze EGC izolovat z PGC mezi 8.5 - 12.5 dpc, později to již nelze - PGC a následně EGC lze izolovat in vitro z ES buněk (lidských i myších) - m/hEGC jsou závislé na LIR během časné kultivace i na FGF2 a Stem cell faktoru (SCF) (+ feeder & FCS/SR). - Exprimují podobné markery jako ES buňky, lidské EGC jsou fenotypem více podobné mES než hES (morfologie + exprese SSEA-1!; u hES se SSEA-1 exprimuje až s jejich diferenciací) Gene 8.5 dpc PGCs EG cells 5 7 14 20 1 2 3 e Group 1 Oct-4 + + + + + + + + Sox-2 - - + nanog + + + + + + + + Dppa5(Esg-1) - - - - - - - + Sal 14 + + + + + + + + mRifl - + - + - - - + E-cadherin + + + + + + + + TNAP - - - - - - - + Rexl £Z(p42) + + + + + + + + Utfl + - - - - - + Dppa3 (Stella) + + + + + + + + Sox 15 + - + + Grb2 - + + + + + + + P ů Psa* ; ŕ ô PGC signature 1-■ 2-6 blue - ES specifický patem red - PGC specifický patern purple - ES/PGC specifický patern green - nevýznamné pro specifikaci ES/PGC 1 2 3 4 5 6 7 II Kif4 If" 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 I II Tbx3 Pou5f1 Fbxo15 I Zfp42 K1Í2 Mm. Ill.m III.... III.... Sox13 ll.llll ...ml ..ml m imm llllll. Psxf ...Ihl lpo9 in mi As? J ml o CO CO O CO CO ro O u CO CO CO O OJ CO CO o CO CO cn 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1. R1 2. E14tg2a 3. TMA5 4. 12.5 male PGC 5. 12.5 female PGC 6. 13.5 male PGC 7. 13.5 female PGC Schema předpokládaného zapojení FGF, LIF a KL (c-Kit ligand = Steel factor (SF)/ stem cell factor (SCF) v regulaci sel-renewal EG buněk Donovan, 2003 Vztahy mezi pluripotentními buňkami a některé klíčové regulační komponenty těchto buněk In vivo In vitro ^Soma^ Oct4, BMP4. BMPSb I Oct4, STAT3, •*— Nanog SI, Ter, iv, pgctl, p53, mTR. PTE N PGC St, LIF, FGF2, RA, PTEIM, cAMP Ectoderm Mesoderm Endoderm Ectoderm Mesoderm Endoderm SI- Steel locus, Ter- Teratoma locus, pgctl - primordial germ cell tumor susceptibility locus, PTEN -Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, mTR (mTOR) - serine-threonine kinase mammalian target of rapamycin Donovan, 2003 Není původ ES buněk v P6C ??? Není původ ES buněk v PGC ??? Gene Species ES EGC LGC ICM PE Pou5fI (Pesce and Scholer, 2001) M + + + + + Nanog (Chambers et al., 2003) M + + + + + Dppo3 (Saitou et al., 2002) M + + + + + IfitmS (Saitou et al., 2002) M + + + + + Kit (Horie et al., 1991) M + + + - N/D DAZL (Clark et al., 2004) H + + + N/D Ddx4 (Toyooka et al., 2003) M + Akp2 (Chiquoine, 1954) M ■ ■ + ■ ■ Zfp42 (Rogers et al., 1991) M + N/D N/D + Fgf5(Haub and Goldfarb, 1991; Hebertetal., 1991) M N/D N/D ■ Gbxl (Chapman et al., 1997) M ■ N/D N/D ■ — Zwaka, 2005 M- myš; H -člověk; N/D - netestováno; ES - embryonální kmenové buňky; EGC - časné primordiální zárodečné buňky (!); LGC - pozdní primordiální zárodečné buňky; ICM - vnitřní buněčná masa; PE - primitivní ecdoderm/epiblast Kmenové buňky teratomu / teratokarcinomu - ECC Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells) Izolované rozkultivováním a klonální selekcí buněk teratomu / teratokarcinomu Lidské spontálně, myší indukované transplantací časných embryonálních buněk do dobře vyživované tkáně (varlata, ledvina kapsa, břišní dutina,...), musí být imunotolerance Podobné vlastnosti jako ES buňky, ale méně závislé na specifických růstových faktorech (+) Tvoří také chiméry, ale nedokonalé, většinou hynou v průběhu embryogenéze (-) Většinou snížená schopnost pluripotence jak in vivo, tak in vitro (-) Obecně nestabilní genotyp a časté aneuploidie (-) Modelové studie genetické nestability a diferenciace, vzniku teratomu Levnější alternativa k ES buňkám, lepší stabilita v experimentálních systémech jak ES (+) Neurální lišta a kmenové buňky neurální lišty (B) Pluripotent /GN^-^Self neural crest vMFC,^^)renewa] Multipotent /GN\ neural crest cells l]viFy \MCJ /±\zx Intermediate progenitor ■< cells Committed precursor cells (gnm) I (gnf^) (gmf) (gnc) (So (gmc) •© N Neuron gm GLia Melanocyte Fibroblast Cartilage fj Bone and cartilage precursors unique to cranial neural crest cells (ncc) f~J Myofibroblastic (nonskeletal) precursors arise from cranial neural crest cells fj Neural (glial, neuronal) and melanocyte precursors common to trunk and cranial neural crest cells (i) Neuroectoderm / Notochord Migrating neural crest Neurons, Schwann cells, pigment cells A) Kmenove bunky trofektodermu (trofoblastu) FGF-dependent (FGF4, FGFR2); Cdx2, Eomes, Errß B) Kmenove bunky primitivniho entodermu (hypoblastu) XEN - bunky extraembryonälniho entodermu Polar TE Secondary giant cells Implantation -► Extraembryonic ectoderm (ExE) Mural TE Primitive streak Proamniotic — cavity E4.5 E5.5 Yolk cavity E6.0 Reichert's^ membrane __Embryonic rf ectoderm E7.0 zärodecny epiblast / embryoblast \ ,r primitivni ektoderm ICM allantois blastomery mezoderm zloutkoveho vaku 1 \~* ^ trofektoderm parietälni entoderm -+ linie trofoblastu Regulace kmenových buněk trofoblastu signály z epiblastu Polar \ t roph ectoderm proliferation FGFR2 p 1 Extraembryonic ectoderm Mural trophectoderm Endoderm mEomes Cdx2 I Errß proliferation | ^ a FGFR2 ? -4-4 FGF4 ? E pi b last