Amplifikační metody v molekulární diagnostice mikroorganismů doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu. cz Přírodovědecká fakulta MU, 2012 Doporučená literatura molecular Microbiology Diagnostic Principles ami Practice 1) Persing et al. (1993): Diagnostic Molecular Microbiology, ASM Press, Washington, D.C. 2) Persing (2011): Molecular Microbiology - second edition, ASM Press , Washington, D.C. Obsah přednášky 1) Amplifikace cílové sekvence metodou polymerázové řetězové reakce 2) Příklady aplikací PCR v mikrobiologii 3) Amplifikační systémy založené na transkripci 4) Technologie SDA 5) Amplifikace sondy a signálu neseného sondou - amplifikace replikázou Qp, ligázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce Dnes nejrozšířenější metoda molekulární biologie Kdo za to může ? Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR) umožňuje selektivní zmnožení (amplifikaci) určité oblasti DNA v podmínkách in vitro; a to procesem, který připomíná replikaci DNA in vivo PCR probíhá v cyklech denaturace annealing Množení a mplikonu Cyklus č. Primární Sekundární Amplikony Celkem (proX=1) 0 0 0 0 1 1 2 0 0 2 2 2 2 0 4 3 2 4 2 8 4 2 6 8 16 5 2 8 22 32 Obecně 2x x(2n-2) (2n-2n)x (2n)x X = počet matríc na počátku, n = počet cyklů Výtěžek PCR Cyklus č. Primární Sekundární Amplikony Celkem 10 2 18 1 004 1 024 20 2 38 10 485 438 1 0242 30 2 58 ~ 1.1 x 109 1 0243 40 2 78 ~ 1.1 x 1012 1 0244 50 2 98 ~ 1.1 x1015 1 0245 r A teď" nás čeká šílené počítání! © Výtěžek PCR - příklad Kolik cyklů PCR musíte použít, aby bylo možno detekovat amplikony o velikosti 500 bp vzniklé z jedné kopie dsDNA ? Zařízení (transluminátor) detekuje 5ng DNA. Výtěžek PCR - řešení Musí proběhnout alespoň 34 cyklů Řešení je uvedeno v samostatném souboru ve Wordu Primer forward a reverse Pozice primerů na cílové molekule DNA určuje specifičnost a délku amplikonu „Syntéza DNA probíhá jen ve směru 5'^ 3". Tak to příroda stvořila! Tedy primery musí začínat 5-koncem a končit 3'- koncem. Na 3'- konci je OH skupina, ke které se připojuje vstupující Narůstání nukleotidového řetězce o Primer forward > musí svým 3- koncem směřovat „dovnitř" budoucího amplikonu > je komplementární ke „spodnímu" řetězci > ale má sekvenci „horního" řetězce TGATGCGTTCGTATCATT AATCGATGGTTTCGTATC forward AC TACGCAAGCATAGTAA T TAGC T AC C AAAGC AT AG Primer reverse > musí svým 3- koncem směřovat „dovnitř" budoucího amplikonu > je komplementární k „hornímu" řetězci > ale má sekvenci „dolního" řetězce ACTACGCAAGCATAGTAA . , T TAGCTACCAAAGCATAG POZOR !!! Primery se zapisují ve směru 5*3'5 tedy 5 - konec nalevo a 3 - konec napravo Platí to jak pro primer forward (kde je to jednoduché), tak pro primer reverse - podívejte se na další snímek, jak to dopadne !!! Jak zapsat primery „na papír" Ačkoli na schématu leží primery takto: TGATGCGTTCGTATCATT .......................................AATCGATGGTTTCGTATCI forward reverse ACTACGCAAGCATAGTAA....................................... TTAGCTACCAAAGCATAgI Napsat „na papír" je musíte takto forward reverse A co když se spletu ? Podívejte se, co se stane Když napíšete primer reverse takto reverse > syntéza z obou primerů bude probíhat ve stejném směru > nebude docházet k amplifikaci TGATGCGTTCGTATCATT forward AC TACGCAAGCATAGTAA T TAGC T AC C AAAGC AT AG Když napíšete primer reverse takto reverse > polymerace z takového primem nemůže probíhat, řetězce nejsou antiparalelní forward AC TACGCAAGCATAGTAA T TAGC T AC C AAAGC AT AG A teď" zase nějaká otázka! © Návrh primem - příklad Napište sekvenci primerů, které by mohly amplifikovat vyznačenou část daného úseku dsDNA - znáte sekvenci jen jednoho z řetězců - primery pište ve směru 5 - 3' 5 TGA TGC AAA GTT CGC TCA GGT ACG ATT CCC AAA TGT GGA GCT TAG TCG ATG ATG GGC AAA TCT GTG ATT ATC CGA CGT CCC ATG TGC GTC AAA TGC CGT AGG ACC CTA TTT TGA CGT CCT GCT GGT ACG CAT CAT CCC TGG TGA CGT CCT ACG TGC TGC GCT CGC ACG ATG CGT ACG AAC GCT CGT CGG - 3 ' Jak dlouhý bude vzniklý amplikon ? Návrh primem - řešení Primer forward AAA GTT CGC TCA GGT ACG - Primer reverse CGT ACG CAT CGT GCG AGC - Amplikon bude mít délku 171 bp Technické provedení PCR Termocyklery ^mikroprocesorem kontrolované zařízení, které obsahuje kovové reakční bloky vyhřívané a chlazené polovodiči (Peltierova pumpa), vodou, vzduchem nebo mikrovlnami < - 9 m' Termocyklery dokáží automaticky rychle měnit teplotu v reakčních blocích mezi třemi základními teplotami PCR cyklu Co se děje uvnitř termocykleru ? Konec reakce | 3,5 =5, 2'5 E 2 +- 1,5 O >o 1 o Q. 0,5 Výsledek PCR záznam z elektroforézy v agarózovém gelu 100 bp ladder Zopakujte si faktory ovlivňující PC R Faktory fyzikálni 1) Počáteční denaturace 2) Připojení primem 3) Syntéza nukleotidových řetězců 4) Počet cyklů 5) Závěrečná extenze Faktory chemické 1) Množství Taq polymerázy 2) Reakční puf r 3) Množství dNTP 4) Primery 5) Objem PCR reakce 6) Kvalita DNA A jak byste naamplikovali virus HIV? RT - PCR Využití PCR pro detekcí mikroorganismů Specificita Senzitivita Detekce a Identifikace Primární detekce Sekundární detekce Identifikace Evaluace PCR systémů Převzaté z literatury Nově vyvíjené Panely pozitivních a negativních kontrol Test specificity PCR reakce Detekční limit PCR reakce Postup vyšetření Způsob odběru vzorku Manipulace se vzorkem Uskladnění vzorků Vlastní PCR Systém PCR kontrol Vyloučit kontrola inhibice negativní izolační kontrola Zajistit pozitivní kontrola pozitivní izolační kontrola A ještě něco pro ty, kteří rádi počítají Příprava primerů - příklad V jakém množství rozpustíte lyofilizovaný vzorek primerů, aby jeho koncentrace byla 100uM ? Vzorek obsahuje 138,6 ug primerů Molekulová hmotnost tohoto primem (o délce 18 nukleotidů) je 5 119 Příprava příměrů - řešení ve 271 yl Použití primerů - příklad Jaké množství primeru ze zásobního roztoku 100uM napipetujete do PCR reakce o objemu 20ul jestliže chcete do reakce dát 10pmol primeru ? Použití primerů - řešení 1M roztok.........1mol částic / litr (1|jmol částic / 1mM roztok......1nmol částic / |jl 1|jM roztok......."Ipmol částic / |jl 100 p M roztok.......lOOpmol částic /pl 10pmol částic.....0,1 m' Amplifikační systémy založené na transkripci Transkripčně amplifikační systémy Využívá transkripci in vitro a nikoli replikaci s Taq polymerázou > nejběžnější varianta je známá pod názvem NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) nebo 3SR (Self-sustained Sequence Replication) > je vhodnější pro detekci molekul RNA > využívá RNA polymerázu > je to isotermický proces Je to kontinuální série zpětných transkripcí matrice RNA a transkripcí vzniklých DNA Průběh N AS BA RNA matrice DNA primer As promotorem pro T7 RNA-polymerázu Průběh N AS BA RNA matrice Zpětná transkriptáza Průběh N AS BA RNA matrice RNáza H - degradace RNA Průběh NASBA Vznikla dsDNA s promotorem pro T7 RNA polymerázu DNA primer B Průběh N AS BA Vznikla dsDNA s promotorem pro T7 RNA polymerázu Transkripce T7 RNA polymerázou A tím skončil první „cyklus" Průběh N AS BA Produkty RNA z 1. cyklu DNA primer B Průběh N AS BA Produkty RNA z 1. cyklu zpětná transkriptáza Průběh N AS BA RNáza H Průběh NASBA Vznikla dsDNA s promotorem pro T7 RNA polymerázu A vracíme se zase na začátek Vylepšené přístupy > K molekulám RNA jsou připojovány molecular beacons, což zvyšuje citlivost reakce ^^v^-™^^— Praktické využití? > Molekulární diagnostika lidského papilomaviru > Detekce rezistence k azidotyminu u viru HIV-1 > Detekce obtížně kutivovatelných bakterií (Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis) Metoda SDA strand displacement amplification amplifikace vytěsňováním řetězce > Metoda využívá schopnosti DNA polymerázy iniciovat syntézu DNA v místě jedno-řetězcového zlomu v cílové molekule a vytěsňovat řetězec se zlomem během nové syntézy > Vytěsněné řetězce jsou substrátem pro další cyklus SDA Jedná se o izotermickou reakci Průběh SDA denaturace dsDNA Průběh SDA pripojení primeru § Průběh SDA Polymerizace s dNTP a dNTPaS dNTPaS = thio substituovaný NTP, neštěpitelný Průběh SDA Vytvoření jed no řetězcové ho zlomu ExteVí^sl^íttJtfrroázou A všechno se opakuje připojeni primerů Využití SD A > Detekce obtížně kultivovatelných mykobakterií > Detekce Chlamydia trachomatis a Neisseria gonorrhoeae (Becton Dickinson ProbeTec ET assay) > Detekce Herpes Simplex Virus I a II (BD ProbeTec) > Diferenciace Saccharomyces cerevisiae metodou AFLP provedenou technikou SDA Další informace k detekčním systémům na bázi SDA se dočtete na komerčních stránkách firmy Becton, Dickinson SDA na čipu Lab Chip, květen 2012, DOI:10.1039/C2LC40384F > Elektrochemické bezkontaktní měření vodivosti v reakční komůrce v reálném čase > S rostoucím počtem produktů roste vodivost > Citlivost 0,1 pg/ul, minimální pozadí > Žádné značení DNA Jaký jiný postup byste použili? ^^^^ 1) Oživte své znalosti o restriktázách 2) Na stránkách www.neb.com najděte termín „nicking endonuclease" 3) Najděte nějakou restriktázu, která by byla použitelná i bez thiosubstituovaných dNTP Amplifikace sondy a signálu neseného sondou Těmito metodami amplifikujeme^y sekvence, které jsou pak použity ' jako sonda při hybridizaci a umožní tak zesílení signálu nebo selektivní detekci amplikonů Amplifikace replikázou Qfi > replikáza Qp je RNA dependentní RNA polymeráza > pochází z RNA bakteriofága Qp (Lentiviridae) > rozpoznává specifickou sekundární RNA strukturu, ale toleruje i vložené sekvence > sonda nese rozpoznávací sekvenci pro polymerázu + místo pro připojení k cílové sekvenci > volná sonda se odstraní RNázou III Jak reakce probíhá substrát pro replikázu pomocne sondy specifická sonda Hybridization Capture. Wa i h Del Ban 2nd Hybridization [ Dauaníbla Tercel Ciptun flmpllf Lcatlun odmytí nespecifických sekvencí uvolnění první pomocné sondy odmytí zbylých nespecifických sekvencí uvolnění druhé pomocné sondy amplifikace Jak reakce probíhá > Všechno při teplotě 37°C > Jediný enzym > Za 30 minut detekovatelné množství produktů > Musí se pipetovat z jedné reakční jamky do druhé > K promývání se využívá separace magnetických kuliček, ke kterým jsou připojeny pomocné sondy Využití metody amplifikace repli kážou Qß > Detekce obtížně kultivovatelných mikroorganismů, např. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae > Detekce Mycobacterium tuberculosis > Kvantifikace molekul RNA viru HIV-1 > Detekce cytomegaloviru Li gázová řetězová reakce > Ligace oligonukleotidových sond, pokud dojde k jejich vazbě na cílovou sekvenci DNA > Vyžaduje 4 oligonukleotidy (LCR-primery) > Dva oligonukleotidy specificky hybridizují k jednomu a dva k protilehlému řetězci Ligace termostabilní DNA-ligázou (z Thermus aquaticus) 3' 5 5'. Mechanismus ligace GA ATTC 3 5 ' 3 ' CTTA GA ATTC // CTTA AG AG yS OH samovolné připojení . 3' . 5' . 5' spojení ligázou 5 '. . . GAATTC . 3' + 2 x ATP 3... CTTAAG . 5' LCR probíhá v cyklech Průběh ligázové řetězové reakce denaturace hybridizace ligace Průběh ligázové řetězové reakce denaturace hybridizace ligace Formáty ligázové řetězové reakce > Většinou kvalitativní > Lze aplikovat i kvantitativně > Standardní detekce na gelu > Sonda může být značena např. biotinem,+ fluoresceční značkou nebo digoxigeninem nebo alkalickou fosfatázou > Detekce po zachycení na streptavidin fluorescenčně, barevnou reakcí nebo enzymaticky Příklady využití LCR > Již v roce 1993 použita k vysoce specifické detekci Chlamydia trachomatis (Dille et al. (1993): J Clin Microbiol. 31(3):729-31) > Detekce kmenů Lactococcus lactis exprimujících nisinA a nisinZ (bakteriociny, E234) - hledání strukturních variant genu, rok 2006 > Borrelia burgdorferi (1991), Neisseria gonorrhoeae (1992), Mycobacterium tuberculosis (1993), > Lidský papillomavirus (1990), HSV (1991, HIV (DNA, 1991) Více o aplikacích LCR Wiedmann et al. (1994): Ligase chain reaction (LCR)-overview and applications. Genome Res. 3: S51-S64 Shrnutí 1) Amplifikace cílové sekvence metodou polymerázové řetězové reakce 2) Příklady aplikací PCR v mikrobiologii 3) Amplifikační systémy založené na transkripci 4) Technologie SDA 5) Amplifikace sondy a signálu neseného sondou - amplifikace replikázou Qp, ligázová řetězová reakce