Hybridizace a její využití v mikrobiologii doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2012 Obsah přednášky 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southern ův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace 7) Příklady využití metod hybridizace v analýze mikroorganismů - RFLP, reverzní hybridizace, spoligotypizace Doporučená literatura Tentokrát se musíte spolehnout na základní literaturu + odkazy na odborné publikace uvedené v přednášce Hybridizace > reasociace dvou jednořetězcových DNA nebo RNA, pokud mají jejich sekvence úplně nebo částečně komplementární báze ..........i i i I I I I I I I I I I I I I I I I I i i i i i i i i i i i i i i........ j > nemyslí sejí ale spojování jednořetězců, které byly součástí téže molekuly) = renaturace Hybridizace je založena na schopnosti NA denaturovat a renaturovat pH ^ PH dvojšroubovice DNA denaturace renaturací se obnoví na jednoduché řetězce dvojšroubovice DNA (po narušení nukleotidových (znovu se spojí nukleotidové páry) párů) © Espero Publishing, s.r.o. Co to je denaturace DNA > oddělení komplementárních vláken DNA působením vysoké teploty (90-100°C), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) > Při denaturaci se zvyšuje absopce světla při vlnové délce 260 nm (tzv. hyperchromní efekt) > Je to důsledek změny v uspořádání bází Co to je hyperchromní efekt > Spojené řetězce snižují absorbanci > Při denaturaci absorbance stoupá o 30-40% > Řetězce drží pevně pohromadě dokud se nedosáhne Tm, pak se duplex rychle rozpadá Temperature, "C http://members.tripod.com/arnold_dion/RecD NA/Fig1-7.gif Co to je renaturace DNA > opětná tvorba dvou řetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing") podmínek > nastává při pomalém ochlazování (65°C) roztoku teplem denaturované DNA > nenastává při prudkém ochlazení roztoku denaturované DNA > při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA > rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí Faktory ovlivňující tvorbu hybridů > teplota > koncentrace solí > stupeň komplementarity > délka fragmentů DNA RNA strand DNA strand Nucleic Rcid Hybridization Využití hybridizace > test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) > detekce molekul DNA a RNA, které jsou komplementární k jakékoliv izolované nukleové kyselině > vyhledávání sekvencí v genových knihovnách > vyhledávání sekvencí v cytologických preparátech > charakterizace sekvencí > mapování genomu > při polymerázové řetězové reakci Typy hybridizací > hybridizace v roztoku > hybridizace na pevném povrchu > hybridizace in situ (FISH) - mapování chromozómů a specifických lokusů > DNA, RNA arrays Hybridizace v roztoku Samotná se téměř nevyužívá, většinou spojená s další detekční technikou > S1 mapování (detekce exonů a intronů hybridu DNA/mRNA) > Denaturační gradiendová gelová elektroforéza (DGGE) > Heteroduplexní analýza S1 mapovaní Význam pro mapování složených genů ^%AS^S^n^ hybrid ,^V\v^S1^clease ^Hi Páry CG drží více pohromadě než páry TA \ HegMVieaHng ot angle strands \ hurnodiipion h«1e«x)uplex heteroduplax homodmtex 1 Mr-tnng beharvtouf Denaturing gradem gel wťm m/m (b) I lna easing dtKwiTiiraiit M«l*roduptam» Hornovi uptexes Podobně funguje TGGE Analýza heteroduplexů > Molekuly dsDNA vznikají z řetězců, které pocházejí z různých zdrojů > Výsledné struktury nejsou 100% komplementární, z toho plyne označení heteroduplex > Obsahují smyčky a bubliny v oblastech, kde se sekvence DNA liší > Struktury lze pozorovat mikroskopicky -heteroduplexní mapování Podívejte se na heteroduplexní mapování v základní učebnici Analýza heteroduplexů Heteroduplexy se pohybují pomaleji než homoduplexy Wlld Typ* ioooooo0dooooooc loooooofooooooet Mi i/ HotjKoAjplaxfts dup*** Analýza heteroduplexů Homoduplexy a heteroduplexy lze rozlišit i kapilární elektroforézou Temperature Modulated Heteroduplex Analysis Widtypfi Mutant Hsíeroduptexss Hornod telexes fMHUH 5-1 mV 4 5 5 Retention tims (mih) Hybridizace na pevném povrchu > Probíhá na speciální membráně > Vzorek se nanáší přímo na membránu = tečková hybridizace (dot blot) > Vzorek se rozdělí na gelu a pak se přenese na membránu = Southernův přenos (Southern blot) > Základem hybridizace je obvykle značená sonda o známé nukleotidové sekvenci Blotting = přenos > Southern blotting (Dr. Edwin Southern) = DNA > Northern blotting = RNA > Western blotting = proteiny > southwesternový přenos - proteiny vázající se na DNA (sondou je DNA) > north wester nový přenos - proteiny vázající se na RNA (sondou je RNA) K čemu se využívá Southernův přenos > Identifikace přítomnosti genu v materiálu vůbec > Identifikace genu za účelem jeho klonování > Využívá se tam, kde je dostupné pouze malé množství vstupního materiálu nebo je vysoké pozadí Příprava hybridizačních sond Sondy radioaktivně značené > Nick translace > Vyplnění jednořetězcových konců > Nahodilé značení > Zpravidla se využívá radioaktivní fosfor 32P Sondy fluorescenčně značené > Značení biotinem > Značení digoxigeninem > Značení křenovou peroxidázou > Citlivější, bezpečnější, dnes už používané častěji Nick translation Posun jednořetězcového zlomu DMaü pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT pTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA Pancreatic DNasel OOl -f-6X0 gm h pApG CpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT PTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA I 1.5' 3' exonuclease \ E. coli DNA 2. 5' 3' polymerase / polymerase I dATP. dCTP-» " dGTP.dTTP T f T T °*/ \ pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpT ApTpT PTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA www.ncbi.nlm.nih.gov Zopakujme si: Klenowův fragment > syntéza ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 3 - 5' > tam, kde se neodbourává primer > sekvenování, značení DNA 5' 3' Značení konců nukleových kyselín A) 5 0: □ 3 B) t AATTCC Gc f> AATTCC TTAAGC n 5' AATTCC Polynucleotide kinase □ 3' galo/-tofl DMA Digest with restr iction nuclease to give 5' overhangs (e.g. EcoRI) □ G 3' □ CTTAA 5' 1 Klenow DNA polymerase d ATP- dTTP D GAATT 3' □ CTTAA 5 Restriction nuclease cleavage at internal site to give different sized fragments T T H GAATT TTAAGI-= * • Purify D CTTAA Purify Key: T Labeled nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov Nahodilé značení „random primer DNA labeling" = prostřednictvím náhodných hexanukleotidů 5' 3 — I Denature and anneal in presence of mixture of random hexanucleotides 5 3' 3' 5 Klenow subunit of DNA polymerase __„j; -j, dATR dCTP -+ dGTP. dTTP 3<ř 5< i 1 i 1 1 .T TT_T T T T iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii i 5' Key^ k f Labeled nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov Značení biotinem Lze využít všech tří základních postupů > Nick translace > Vyplnění jed no řetězcových konců > Nahodilé značení biotin-dUTP 11111111111 ........... 11111111111 ........... značeni 4 4 detekce avidinem s fluorescenční značkou <- hybridizace 11111111111 11111111111 11111111111 11111111111 11111111111 11111111111 Praktická aplikace značení sond Příprava sond pro diferenciací kmenů M. a. paratuberculosis Celkem 3 sondy detekující části inzerční sekvence \S900-inzerční sekvence specifické pro M. a. paratuberculosis l Psrl-1045bp \S900 Celková sonda - 958bp Sonda 1 -412b Sonda 2 - 303b Základní kroky pří přípravě sond > Amplifikace specifických fragmentů PCR > Purifikace amplikonů > Značení sond peroxidázou > Kontrola koncentrace sondy Značení sondy dsDNA povaření a ochlazení komplexy peroxidázy pozitivně nabité Značení sondy peroxidáza se váže k DNA špatně glutaraldehyd peroxidáza se váže k DNA kovalentně Detekce peroxidázou značené sondy H202 detekční reagencie 1 o matricová DNA značená sonda 02" + H20 zesilovač o luminol detekční reagencie 2 NH2 IH2 + světlo o o Postup při Southernově přenosu 1. rozdělení fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou 2. denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting") 3. inkubace filtru se značenou jed n o řetězcovou sondou: hybridizace sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou filtru 4. odmytí nenavázané sondy 5. detekce navázané sondy - vizualizace hybridů Southern blotting fragmenty DNA na elfo gelu filtrační papír r denaturace NaOH membrána přenos DNA z gelu na membránu otisk DNA na membráně inkubace se značenou cDNA vyvolání RTG filmu Southern blotting stoh papírových ručníků (AI neznačen* DNA rozštěpená reštrikční nukleézou odstranění mtrocelulosového papíru s pevná navázanou DNA nitrocelulosová membrána gel značené DNA různé velikosti slouží jako standardy agarosovy gel FRAGMENTY DNA JSOU ODDĚLENY ElEKTROFOREZOU NA AGAROSOVEM GELU mycf houba alkalický roztok ODDĚLENÉ FRAGMENTY DNA PŘENESENY NA NITR0CELUL0S0VOU MEMBRÁNU ZNAČENA DNA-SONDA JE HYBRIDIZOVANA S ODDĚLENOU DNA zalepený plastický sáček označená DNA-sonda v pufru OZNAČENA DNA-SONDA HYBRIDIZOVANA S KOMPLEMENTÁRNÍM PRUHY DNA JE ZVIDITELNĚNA AUTORADIOGRAFlI (El proutky značených standardů značené proujky z pokusu © Espero Publishing, s.r.o. Způsoby přenosu („blottingu") > kapilární přenos > elektroforetický přenos > vakuový přenos Kapilární přenos Elektroforetický přenos Vakuový přenos Fluorescentní in situ hybridizace fluorescence in situ hybridization (FISH) Metoda sestává ze tří základních kroků > Fixace vzorku na mikroskopickém sklíčku > Hybridizace značené sondy k homologickým fragmentům na genomové DNA > Enzymatická detekce hybridů sonda-cílová sekvence > Sondy radioaktivně značené > Sondy fluorescenční: rychlejší, silnější signál, simultánní diferenciace různých cílů Ukázky FISH fluorescence in situ hybridization FISH v mikrobiologii > Umožňuje detekci i nerostoucích bakterií > Sonda je druhově specifická a míří zpravidla ke genu pro 16S rRNA > Metoda je vhodná pro fylogenetické, ekologické, diagnostické a environmentálni studie > Kombinuje preciznost molekulární biologie s mikroskopickým pozorováním > Je možno pozorovat výskyt bakterií v kontextu s morfologickou charakteristikou napadené tkáně > Citlivost až jediná bakterie, metodicky mimo PCR Typický FiSH protokol 4 základní kroky 1) Fixace a permeabilizace vzorku 2) Hybridizace 3) Promývací kroky -odmytí nenavázané sondy 4) Detekce značených buněk mikroskopicky nebo průtokovou cytometrií Charakteristika sond Dlouhé 15 až 30 nukleotidů Fluorofor Barva Excitace Emise Alexa 488 zelená 493 517 Cy3 červená 552 565 Cy5 červená 649 670 DAPI modrá 350 456 Fluorescein zelená 494 523 Rodamin červená 555 580 TAM RA červená 543 575 Texas red červená 590 615 Zodpovězte otázku Jak dlouhá musí být minimálně sonda, aby našla jedinou specifickou sekvenci v bakterii, jejíž genom má velikost 4,0 x 106 bp? 4,0 x 106 = 4X ln(4,0x106) = Xln(4) X = ln(4,0x106)/ln(4) X = 11 Jak označit sondu? Přímé značení koncové značení 3'- koncové značení Jak označit sondu? Nepřímé značení Reportérova molekula V 4 digoxigenin Značení enzymem v 4 HRP Jak označit sondu? Nepřímé značení - polyribonukleová sonda Dvě hlavní oblasti využití FISH v mikrobiologii > Analýza vzorků potravin > Studium biofilmů • ♦/ fy i * - • - v " • ■ - v 1«1 1 • Green fluoresáng cefts {£. ooíi) Yeltow ftuorescing oells (K. pneunvntae) Redfluoresoing oefc (P. aĚrvgmosa) Moced Posrtive Varianty FISH ACM-FISH ■ e-FISH ■ QD-FISH armFISH ■ Fiber-FISH ■ Rainbow-FISH CARD-FISH ■ Flow-FISH ■ Raman-FISH catFISH ■ Fusion-Signal ■ ReD-FISH CB-FISH FISH ■ Reverse-FISH CO-FISH ■ Halo-FISH ■ RING-FISH COBRA-FISH ■ Harlequin-FISH ■ RNA-FISH COD-FISH ■ Immuno-FISH ■ RxFISH COMBO-FISH ■ LNA-FISH ■ Split-Signal FISH Comet-FISH ■ M-FISH ■ T-FISH Cryo-FISH ■ ML-FISH ■ 3-D FISH D-FISH ■ PCC-FISH ■ Zoo-FISH DBD-FISH ■ PNA-FISH ■ Q-FISH BioTechniques 45:385-409 (October 2008) Další čtení Bottari B (2006): Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects. Appl Microbiol Biotechnol (2006) 73:485-494 http://www.nottingham.ac.Uk/biosciences/divisions/food/r esearch/projects/foodmicrobiology.aspx http://www.rapidmicrobiology.eom/news/1431h22.php Vybrané aplikace hybridizačních technik v mikrobiologii > Poly m orf ismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) > Ribotypizace > Metoda reverzní hybridizace > Metoda spoligotypizace Metoda RFLP > Reštrikční fragmenty rozdělené na gelové elektroforéze > Detekce vybraných polymorfních úseků značenou sondou > Rozdíly ve spektru jsou dány ztrátou nebo získáním restrikčního místa, delecí nebo inzercí > Jsou možné i změny v počtu repetitivních sekvencí nebo translokace > Sondy z náhodně vybraných sekvencí > Sondy ze specifických esenciálních genů nebo genů pro faktory virulence > Sondy z IS, transpozonů a repetitivních sekvencí > Sondy z genů pro rRNA Zjednodušený princip RFLP Porovnání elektroforézy a hybridízace DNA obarvená autoradiogram ethidium bromidem Naznačení analýzy RFLP profilu Analýza změn ve fragmentu 400 bp + RE - RE + 50 - 50 Velikosti 400 250 600 450 350 fragmentů 150 600 500 —■ 400 —■ í::::::j E----"j ĺ: 250 200 i-1 i-1 ĺ::::::j i-1 i-1 150 100 —■ 75 —■ Počet změn 0 3 3 2 2 Využití RFLP v epidemiologii původců mykobakterióz > Epidemiologie paratuberkulózy, IS900 > Epidemiologie aviární tuberkulózy > Analýza kmenů MAC y rámci jednoho chovu > Analýza kmenů MAA \S901 u jedince > Analýza smíšených infekcí kmenů MAC Inzercnf sekvence u vybranych mykobakterif M. avium subsp. avium serotypy 1-3, M. avium subsp. silvaticum \S901 IS 1245 M. avium subsp. hominissuis serotypy 4-6, 8-11 a 21 IS 1245 FR300bp M. avium subsp. paratuberculosis IS 900 M. intracellular serotypy 7,12-20, 22-28 Inzerent sekvence transponují > Kopie IS se chovají jako bodové mutace > Důsledkem transpozice jsou různé RFLP profily Pro studium epidemiologie MAA je vhodná \S901 Pro MAP potom \S900 RFLP profily na bázi IS901 - MAA PvuU - \S901 RFLP profily > 25 vícekopiových profilů > 3 profily o malém počtu kopií > celkem 28 RFLP typů Psfl - \S901 RFLP profily ^-- > 4 vícekopiové profily > 1 profil o malém počtu kopií > celkem 25 RFLP typů Pvull - IS901 RFLP profily -1 kbp N A B C D E F G \ I J K L M 0 P Ol 10.0-► 8.0-► 7.0-► 6.0-► 5 0 -► ►— ►— t — ► 4.0-► >- 3.0-► — — — — —► ► ► ► ► — — - - 2.0-► III II AAA A I III I III AA I III III I III III AA I III II A A I III II A A A Mill III - ► ► AAAAA A AAA III II AAA A A III III AAA >— ►— ► ► ►_ n i nm Y YYY II III Pvull - IS901 RFLP profily - 2 ^PNRSTUVWX Z AA AB 10.0 8.0 7.0 e.o ►— ►— ►■ 5.0^----— — — —► — — — ► 4.0 Vybrané Pstl - IS901 RFLP profily A1 B1 C1 D1 L1 Fylogeneze na základě analýzy profilů PvuW Psň 20 40 llllllll lllllll 60 80 1 JO rí 44: 11 n i i i i F H J S K M G S T Q U V p A L N 0 D C E x R H Y 1 20 40 60 80 100 iliinli.iil,min,ilnhIlhIiiiiImmIhmI I I I I I I A15 V obou případech 2 clustery Využití při epidemiologických studiích Původ celkem 137 izolátů RFLP typy získané u ptáků, zvířat a lidí kbp M B C D E F G 10.0-► 8.0-► 7.0-► 6.0-► 4.0-► 3.0-► — — — —► > ► 2.0-► — ► — — —► ► H I ►— ►— ► ► ► ► ►— LMOPQTUZAAAB ►— ►— ►— ► —► ► ► ► —► ► Specifické profily u izolátů od lidí Standardizace metody Dvorská, L. - Bull, T.J. - Bartoš, M. -Mátlová, L. - Švástová, P. - Weston, T.R. -Parmová, I. - Van Soolingen, D. - Pavlík, I.: A standardised Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) method for typing Mycobacterium avium strains links \S901 with virulence for birds. Journal of Microbiological Methods; 2003, 55, 11-27 Analýza klinického případu u člověka Serotyp 6 6/9 9 9 6/9 9 9 PZA INH RFP ETA STM CIPRINOL KLACID AMIKACIN Měsíc Rok XI. XII. I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII IX. Analýza primokultur zo zv 8a 10 sa frV vo cx za va sa 3X za VB IV m 9V ev £9 SS 99 za II I I I I II II II II III III 11 II III III III III 11 II II III II II II 11 II II I I I I I I I I II 1 II III 1 1 II 1 III II 1 II III 1 1 II 1 II 1 1 1 II 111 II 1 llll II 1 1 i nu i i 1 llll II 1 1 ill i 1 1 1 1 II 1 1 i I I 1 in 1 1 II III Mil 1 1 III II III llll II 1 II 1 1 iiii II II 1 1 llll II II 1 1 II 1 1 llll II II 1 1 1 IM 1 II 1 1 1 II 1 1 II 1 1 1 11 1 1 llll n 1 1 11 1 1 llll II I II 1 1 llll II 1 1 II 1 1 llll ji 11 1 1 llll II i i 1 IIIIII lllll II 1 1 ii 1lllll iiiiii j ■iiiii lllll 1 11 1 III III iiiii II 1lllll iiiii II 1 IIIIII iiiii II 5^ 001 06 m%\r\y\ uoiujepumfds ezÁ/euv Pracovní hypotézy 1) Opakovaná infekce z vnějšího zdroje 2) Dočasné utlumení infekce a její reaktivace 3) Selekce rezistentních kmenů antituberkulotiky Studium přenosu MAA mezi různými farmami Farma C 1 x D Ke studiu epidemiologie M. a. paratuberculosis se používá \S900 RFLP profily na bázi IS900 - MAP BstEM - \S900 RFLP profily s-- > 33 vícekopiových profilů > 3 profily s nízkýmpočtem kopií > celkem 35 vícekopiových profilů Psů - \S900 RFLP profily > 24 vícekopiových profilu > 1 profil s nízkým počtem kopií > celkem 25 RFLP typů BstEII - IS900 RFLP profily I BstEII - IS900 RFLP profily II F M N O P Q R S T UVWX BstEII - IS900 RFLP profily III Pstl - IS900 RFLP profily I A1 B1 C1 D1 L1 kbp Pstl - IS900 RFLP profily II Kbp Paratuberkulóza u divokých přežvýkavců v ČR (1995-2000) Pavlik et al.. Veterinary Microbiolos v. 2000, 231-251 Paratuberkulóza u faremně chovaných jelenů Detekce tří kmenů různých RFLP typů u jedné krávy V letech1995 až 2001 V roce 2002 C1 C9 C23 Rozklonování izolátu č. 23 Porovnání výsledných RFLP profil Colony number Kbp 2 4 5 7 8 10 12 13 14 16 18 1.6 -> C23 C9C9C9 C9C9C1 C5C9 C1C9C1 C23 C9 C1 C5 Pro studium epidemiologie M. tuberculosis se používá \S6110 IS 6110 RFLP M. tuberculosis, M. bovis a M. caprae 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 2,9 log bp -i-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Std M.tbc M. bovis M. caprae Proč to celé neosekvenujete a hotovo! Není tato metoda dnes poněkud Sekvenování je příliš citlivá metoda a nesnadno odhaluje klonalitu Ribotypizace Varianta RFLP využívající sond připravených z genů pro 16S rRNA nebo 23S rRNA > Sekvence genu pro 16S rRNA se používají k fylogenetickým studiím > Počet kopií genu pro 16S rRNA je malý, do 6 ks > Výsledná spektra jsou jednoduchá > Popsáno u Listeria (80 spekter), Salmonella (97), Escherichia (65) a Staphylococcus (252) Zodpovězte otázku Kde se v buňce nachází 16S rRNA? A kde se nachází 23S rRNA? serotype ribotype pattern ribotype 0) O o Qc < CO q> .52 c 0 c 1 O CO O ■g O 12 10 9,11 8 7 5 4 2 III I I I I II I I II 1, 3, 6 | II II CO O CNJ OJ H/nd Ml/9 H/nd IN/8 H/nd Ml/7 H/nd Ml/6 H/nd Ml/5 H/nd III/4 H/nd Ml/3 H/nd Ml/2 H/nd 111/1 Q) O CC o < (f) (D O 0 1 ! •S 1 O CO •Q O serotype 5 3,4,6,12 2,7 1,8,9,10,11 CM O) 00 h-ID m CO CM CO o> CM <ť> ■ ribotype pater n MIN I I I I I I I I I I I i • • • t • • • A • Í • • m • • t ribotype Cŕol/4 CfoMZ Cfo\/2 Čim Úkol Analýzou výše uvedených spekter ribotypů stanovte počet genů pro 16S rRNA u Actinobacillus pleuropneumoniae, jestliže ani HincňW ani Cfo\ neštěpí uvnitř genu. Ze spekter po štěpení Cfo\ vyplývá, že je zde 6 kopií genu pro 16S rRNA. Spektra po štěpení HincňW nejsou čistá. A ještě jeden, komplikovanější úkol Analyzujte následující spektrum a odhadněte, co se mohlo stát M12345678 9 1011 12 23.11 9.4 6.6 1) Porovnejte vzorek č. 1 a 2 44 2) Najděte další podobné j füll události 2.3 «• — 3) Co je méně pravděpodobné? 2.0 Řešení? Toto jsou možná vysvětlení, zájemci mohou i vypočítat délky změněných úseků M12345678 9 1011 12 1) U vzorku č. 2 došlo k deleci 2311 (nebo u vzorku č. 1 k inzerci) úseku DNA 9.4 6.6 4.4 2a) Podobné mohlo nastat illllll- • mezi vzorky 3-8 (3-1, apod.) z nz. z z z z z z z - 2 události! 23-™___2__=>-- - 2.0 2b) Další možnost 4-7 2c) A ještě jedna možnost 5-6 3) Dvě události versus jedna jsou méně pravděpodobné Odhadněte evoluci ribotypů j* 10 o cn oj oo Vi ~j> S «> o> o -* 1* «3 O N> "O Což třeba takhle á s Cfol/4 (serotyp 5) t Cfol/3 (serotyp 3,4,6 a12) L=l - O" - I — — "O (0 i-* o S 3 Cfol/2 (serotyp 2,7) í Cfol/1 (serotyp 1,8,9,10 a 11) A podobně pro spektrum Haelll Analyzujte následující spektrum a odhadněte, co se mohlo stát 1) Porovnejte vzorek č. 4 a 8 2) Porovnejte vzorek č. 4 a 5 3) Co se stalo u č. 2? M 12 34 5 67 89 10 11 12 4.4 — SeSUll.iiii Řešení? Toto jsou možná vysvětlení, zájemci mohou vypočítat délky změněných úseků 1) U vzorku č. 4 došlo k deleci (nebo u vzorku č. 8 k inzerci) úseku DNA 2a) U vzorku č. 5 se ztratilo jedno reštrikční místo oproti č. 4 (nebo opačně) 2b) Přibyl/ubyl počet kopií 3) ??? M 12 34 5 67 89 10 11 12 4.4 — 2.3 2.0 Metoda reverzní hybridizace > „Sonda" je nanesena na pevný povrch > Cílová sekvence je v tekuté fázi, zpravidla ve formě amplikonu po PCR + cílové DNA sekvence -> sondy A B Tři jednoduché kroky > Izolace DNA ze vzorku > Amplifikace cílové sekvence (PCR) > Detekce značeného produktu na matrici Izolace DNA PCR Detekce Výsledky za (30 minut) (2 hodiny) (10 minut) 3 hodiny Detekční systémy pro mykobakterie I Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. avium M. intracellulars M. kansasii M. malmoense M. tuberculosis complex http://www.hain-lifescience.de Detekční systémy pro mykobakteríe 1—1 ..... ..... ..... ..... ..... ..... .....1 ------ 1 Conjugate Control 2 Urxwrsat Control 3 Genus Control • 5 6 T S 9 IC 11 12 13 H IS U 17 J Specific prob«t š ssysss/ysyyyys * y 1 i Species may possibly be further differentiated *iii- the GeneType Mrcob.ctermm AS 21 For further differentiation use the GenoType Mycobacterium AS 31 For further differentiation use the GenoType MTBC http://www.hain-lifescience.de Detekční systémy pro mykobakterie III http://www.hain-lifescience.de Diferenciace zástupců MT komplex ••**•**••••........ mtlMHMIHII*lll ................... ta*l .................... • •»•• .. . >.....*.»........... .................... •••■■•■••■•■a* - llllliillliHII .......... Conjugate Control Universal Control MTBC Specific gene probes for the differentiation of the Mycobacterium tuberculosis complex J? http://www.hain-lifescience.de IIHIHII Hli IÜHHHUU II HI II MMUIM III I- ill i i miiuimi U I II iiiiiiiii in I Mill IHIHII Ml ?i[ ni i I .....M m - I mum itti ttttttttttttt iff iiiim mi ifiiíiiíiíiíí mini ml immunii s1 Jgj£»# — •# — M — w ta y w H - I" Další systémy > Mul ti rezistentní kmeny Staphylococcus aureus > Detekce Helicobacter pylori + rezistence > Detekce Chlamydia trachomatis > Detekce Bordetella pertussis a R parapertussis > Clostridium dificille - diferennciace mezi nepatogenními, virulentními a hypervirulentními kmeny > Detekce desítek grampozitivních a gramnegativních druhů > Geny pro Shiga toxin > Vankomycin rezistentní enterokoky > Detekce periodontopatogenních bakterií http://www.hain-lifescience.de Spoligotypizace Mezerníky dlouhé 35-41 bp 43 specifických oligonukleotidových sond vázaných na membránu Membrána pro spoligotyping 1) Membrána se 43 specifickými sondami 2) Hybridizuje se s produktem PCR 3) Vyhodnotí se výsledky M.africanur i M. tuberculosis H37Rv IIIIIIIIIIIIIIIIII^^IIIIIIIIIIII^ lliiliiiiiilililllilillliliill i i i i L J L j L . M. tuberculosis Beijing genotype i"i i"i i"i ...... M. bovis BQG M. bovis M. bovis subsp. caprae II II I I M. bovis subsp. caprae M. tuberculosis seal genotype i M. microti type vole M. microti type llama i i i i-i i_i i-i i_i ......... i i i lilii mu mi ........ iili i-i i-i i-i i-i ........ iiliii nun ri n i- ..... n i-i i- ..... ri n n i-....... mini i mi l|Él1Él|ÉI1|l||l|Él1 n in i nun iili in n i mi mimiiini ii ■ ■é ibé iBé i >M 'U 1 I! IIIIIIIIIII IIIIIIIIIII III IIIIII II HU mm ri n n i-....... HIHI II i ri ri ri i-i n ........... III i-i n i-1 i-1 i-1 ■"■ i i i i 1 i i 11 i i i i i i i Profily zástupců komplexu M. tuberculosis M. tuberculosis H37Rv M.africanum M. tuberculosis Manila genotype M. tuberculosis Beijing genotype M. bovis BCG M. bovis M. bovis M. bovis subsp. caprae M. bovis subsp. caprae M. bovis subsp. caprae M. tuberculosis seal genotype M. microti type vole M. microti type llama M. canetti IIIIII II IIIIIIIII I I I III! ■ Ill II I II II Reálný záznam spoligotypizace "ft • ■•• •••••• •• si> » • « ■ - - t l Ä š/fzool } > 0 Vyhodnocení spoligotypizace ::t:: • •••• ::::: :: ti lllíi M tltt ■ S3 S4 Pavlik et al., Vet. Med. Czech, 2002, 47,181-194 483050 Profily izolátů M. bovis z let 1965-2002 1965 1966 1974 1989 1991 19921994 199E 1997 1999 2002 H mu min niltifil ľTTTTTTTTTTTTl □ □ □ □ □ Ii lihl HIHI iMlHHIHMHltHiíŤ □ h nm mi.....minim mím □ h i in i mi >i iitntMiiniiiiin Typový kmen n n n i r □ H Ulli 'Hl.....ľlllllllH I □ MHMHltt HUMUM □ □ □ □ Nejbeznejsi typ Jedinečný typ M. bovis caprae Spoligotypy izolátů M. bo vis u zvířat = Chomutov = (jelen-1991) i Praha = (deer-1999) 1 (velbloud-2002) ii 11 Praha-východ ||(dobytek-1991) s7 M. bow's caprae ZDAR n. S (dobytek-1995) Znojmo |(dobytek-1994) Pavlík et al., Vet. Med. Czech, 2002,181-194. Zlín (kapybara 1989 Levica (dobytek-1992) Vyhodnoťte Proveďte analýzu spoligotypů podle předložené učební pomůcky Shrnutí 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southern ův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace 7) Příklady využití metod hybridizace v analýze mikroorganismů - RFLP, reverzní hybridizace, spoligotypizace