Sekvenování nukleových kyselin a analýza DNA sekvencí doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2012 Obsah přednášky 1) Pojem sekvenování 2) Maxamovo-Gilbertovo sekvenování 3) Sangerova metoda s využitím fluoroforú 4) Pyrosekvenování 5) Nové přístupy k sekvenování 6) Příklad reálné analýzy Doporučená literatura www.farmakogenomika.cz Sekvenování Rozhodující metoda pro stanovení nukleotidových sekvencí > Konečná fáze procesu individualizace jednotlivých izolátů > Metoda je pro většinu mikrobiologických aplikací pnlis presna Metody sekvenování nukleových kyselin Chemická metoda sekvenování (Maxamovo-Gilbertovo sekvencování) Enzymová metoda sekvenování (Sangerovo sekvenování) Pyrosekvenování Chemická metoda sekvenování (Maxamovo-Gilbertovo sekvenování) Podstatou je specifické štěpení molekuly ssDNA po modifikaci jednotlivých bází chemickými činidly s následnou elektroforetickou detekcí v denaturujícím polyakrylamidovém gelu. Chemická činidla jsou specifická pro modifikaci určitých bází: G A+G C+T C - DMS - piperidin - hydrazin - hydrazin + NaCI Chemická metoda sekvenování Příprava ssDNA a značení Modifikace bazí Štěpení ssDNA Odečtení výsledku Chemická metoda sekvenování Příprava ssDNA a značení 5 - GATCAGG - 3' 3 - CTAGTCC-5' Modifikace bazí Štěpení ssDNA Odečtení výsledku Asymetrická PCR Využití vazby biotinylovaného primeru 32 p 32P -GATCAGG - 3' Chemická metoda sekvenování Příprava ssDNA a značení Modifikace bazí Štěpení ssDNA Odečtení výsledku 32P -GATCAGG - 3' + DMS piperidin hydrazin Hydrazin + NaCI Chemická metoda sekvenování 32P -GATCAGG - 3' Příprava ssDNA a značení Modifikace bazí Štěpení ssDNA Odečtení výsledku DMS piperidin hydrazin Hydrazin + NaCI Štěpení piperidinem při vysoké teplotě CO ■o I o > —I o > o o CO ro ■o I o > H o > o o CO ro ■o I o > —I o > o o CO ro ■o I o > H O > o 32P -GATCAGG - 3' DMS 32 P -GATCAG 32P -GATCAGG + < piperidin 32 p 32 p 32 p 32 p + hydrazin Hyd raz i n + NaCI GA GATCA GATCAG GATCAGG 32P - GAT 32P 32P - GATC GATC Reálný výsledek chemické metody sekvenování O H O OHO Převzato z: Site-specific DNA transesterification catalyzed by a restriction enzyme Giedrius Sasnauskas*, Bernard A. Connollyt, Stephen E. HalfordJ, and Virginijus Siksnys*§ * Institute of Biotechnology, Graiciuno 8, Vilnius, LT-02241, Lithuania; flnstitute for Cell and Molecular Biosciences, University of Newcastle, Newcastle upon Ttyne NE2 4HH, United Kingdom; and ^Department of Biochemistry, School of Medical Sciences, University of Bristol, University Walk, Bristol BS8 1TD, United Kingdom Úkol Z výše uvedeného záznamu odečtěte výslednou nukleotidovou sekvenci Výsledek bude tedy asi tento Sangerova metoda d i d eoxy te rm i n áto ry 3' OH H Dideoxyterminátory 3' H H 3' H H Průběh sekvenování 1. denaturace (92-96°C) dsDNA 2. annealing (45-72X) 3. extenze (72°C) Průběh sekvenování 1. denaturace (92-96°C) dsDNA 2. annealing (45-72°C) 3. extenze (72°C) Výsledek sekvenování Následuje rozdělení fragmentů Následuje rozdělení fragmentů Sekvenování - záznam 'AAA6C CTGGGGTGCCTAATGAGTGA GC TA AC TCACATTAAT TGC GTTGC GC TCAC TGCCCGCT' 180 190 200 210 220 230 240 TTCCAGTCGGG 250 AAAC C TGTCGTGCC 260 A GC 1 n y 'GCATTA AT G A ATCGGC CA AC GCGCGGGGA GAG GC GG 0 280 290 300 5T TTGCGT 310 ATTGGGC GCTCTTCC GC 320 33C ľTCC TCGC TCAC T G AC T C GC T GC GC TC G GT C GT TC GGC TGi Kapilární gelová elektroforéza > rozdělí produkty sekvenování podle velikosti > detekuje fluorofory laserem Úkol Na základě výsledků sekvenování zařadte izoláty bakterií čeledi Pasteurellaceae Použijte výukový materiál Pyrosekvenování > Metoda popsaná Mostafa Ronaghi et al. v roce 1990 > Určena pro krátké úseky DNA, SNP a úseky metylované Polymerase v------ACCTTGAGTACCATCTAGGA 5»------TGGAACTCA PP, dATP ATP suífutylase -> (d)ADP Apyrase ATP Luciferase (d)AMP > 4 enzymy > velmi přesná > reakce se záhy „zahltí" Průběh pyrosekvenování (DNA)n + dXTP (DNA)n+1 + PPj DNA polymeráza Průběh pyrosekvenování Poíymerase 3>------ACCTTGAGTACCATCTAGGA y------TGGAACTCA PPi+ APS ATP + S042" ATP sulfuryláza Průběh pyrosekvenování Poíymerase V------ACCTTGAGTACCATCTAGGA 5»------TGGAACTCA (d)ADP (d)AMP ATP + luciferin + 02 AMP + PPl + oxyluciferin + C02 + světlo luciferáza Průběh pyrosekvenování Polymerase 3>------ACCTTGAGTACCATCTAGGA y------TGGAACTCA ATP suífutylase ATP Luciferase dXTP dXMP apyraza Parametry pyrosekvenování > žádné značené primery ani značené nukleotidy > žádná elektroforéza > Principem je uvoln a emise viditelnéhc > Množství uvolněné množství zabudové > Namísto standardn 2-deoxyadenosin-který není substrát Polymerase 3>------ACCTTGAGTACCATCTAGGA y------TGGAACTCA ATP sulfutylase > Rychlost sekvenování = 1 báze za minutu > Délka stanovené sekvence = 100 nukleotidů Pyrosekvenování - záznam Intenzita signálu odpovídá počtu začleněných nukleotidů Sekvenování pomocí hybridizace > Nepřímá metoda využívající DNA čipu > > Výsledek odečten konfokálním mikroskopem Sekvence Q^^na dedukcí T A C G T A A T G C A T C G G C A T G T G A A C C T A C A G A A A C G C Otázka Kdyby byly na čipu naneseny 20 mery, kolik políček by musel obsahovat čip pro sekvenování 1 Mb? Prý celkem 1,112 x 106 Minisekvenování > Metoda využívající technologie DNA čipu > Využívá se pro stanovení jednoduchých nukleotidových polymorfismů > Více variant, metoda je automatizovaná, multiplexní SNP, (CG) (CC) qlql 91*1 9I9I TATA GCCG GCGC lil lllllllllll * O P Exl^rw PCR products • ONA Polymerase Mix o< labeHod ddNTPs 5' 6' Transcnbod RNA o*) labeled ♦ fevera transcriptase ♦ uniabafed oNTPs 4 ► T A CA li í SNP, SNPj SNP3 SNP, SNPj SNP3 TA CA GC CG AC GC í—I—r 7j AA CG CC SNP, -T-O \_ -G-O A. -G-0 Capture 9 9 9 í 9 9 ->. r- ~> la a t. It. **00 00 Products ot pnmer oxtenson n solution Nature Reviews | Genetics Emulsní PCR > Amplifikace probíhá v emulsi (voda-olej) > DNA je fragmentována na úseky dlouhé 300-800 bp > Jednotlivé matrice jsou navázány samostatně na povrch jednotlivých kapek obalených primery Emulsní PCR > Amplikon je výsledkem jedinečné PCR > Méně nespecifických produktů ú oo 1 '—^ Conventional PCR Emulsion PCR Komerční aplikace emulsní PCR 454 sekvenční systém firmy Roche > Produkty PCR jsou sekvenovány pyrosekvenováním 454 sekvenční systém Základní kroky > Tvorba jednořetězcových DNA matríc > Připojení adaptérů a vazba na pevné částice > Amplifikace DNA matric v emulzi > Vytvoření sekvenčních dat > Analýza sekvencí různými nástroji bioinformatiky Podívejte se na komerční prezentaci na stránkách http://454.com/products/technology.asp 454 sekvenční systém Výsledný záznam Další moderní přístupy najdete na http://qrf.lshtm.ac.uk/sequenc inq.htm 454/Pyrosequencing (Roche) SOLEXA (lllumina) Porovnání 454 a polony (SOLiD) 75én5m!cT5nA" (1) Sheering to small fragments prime připojení adapterů destička pyrosekve nování (2a) Linker attachment (3a) Amplification % ^ (4a) Beads applied to picotrter plate (2b) Circulanzation and Imker attachment cirkulalizace a linearizace (4b) Beads immobilizec In a monolayer in an acrylamide matrix •>.•>.•.•.•>••»»» • ••>>>•>•>••>•> •>>»>.»>.«x«»» .agct I..j.ii K (5a) Pyrosequencing by primer extension (5b) Ligation with oligo pools added in cycles ^ncHour^otonmajjing^^^^^^^^^^^^ monovrstva na PAGE ligace značených oligo Hall N J Exp Biol 2007;210:1518-1525 Sekvenování mikroorganismů > První sekvenovaný mikroorganismus = Haemophillus influenzae, 1995, TIGR > V roce 2000 následovaly Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli a Archaeoglobus fulgidus > První eukaryotický mikroorganismus = Plasmodium falciparum, 2002 > Následovaly kvasinky, ... > V současnosti jsou v databázích stovky sekvencí > Podívejte se na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/qenome Úkol Podívejte se do databáze a zjistěte, u kolika halobakterií (třída Halobacteria) je v současné době známa nukleotidová sekvence genomu, a to jak kompletní, tak i částečná Zjistěte totéž u čeledi Pasteurellaceae A ještě u cyanobakterií (kmen Cyanobacteriá) Prehled stävajfcfch a novych technik celogenomoveho sekvenoväni 7 DNA Amplification followed by mass spectrometry r In vitro cloning T Mass Array Jurinke et al. (2002) Sequencing by synthesis T Hybridization and ligation In vivo cloning Sanger method Sanger et al. (1977) Single molecule r Arrayed fragments Braslavsky et al. (2003) Nanopore readers Kasianowicz et al. (1996) J 454 Solexa Polony MPSS Margulies et al. (2005) Bennett et al. (2005) Shendure et al. (2005) Brenner et al. (2000) Hall N J Exp Biol 2007;210:1518-1525 A teď se podíváme na něco praktického Použijte připravený výukový materiál ze sekvenování zástupců čeledi Pasteurellaceae Shrnutí 1) Pojem sekvenování 2) Maxamovo-Gilbertovo sekvenování 3) Sangerova metoda s využitím fluoroforů 4) Pyrosekvenování 5) Nové přístupy k sekvenování 6) Příklad reálné analýzy