Metodologie molekulární fylogeneze a taxonomie hmyzu Bi7770 Andrea Tóthová MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent Metody Molekulární znaky mají oproti klasickým řadu výhod: Je jich libovolné množství Jsou vzájemně distinktní, kvalitativní Umožňují srovnávat i nepříbuzné organizmy Jsou selekčně neutrální Kde se molekulární biologie využívá? •Recentně aplikované technologie – genetické inženýrství, DNA finger-printing v sociální a forenzní sféře, pre a postnatální diagnostika dědičných nemocí, genová terapie, „ drug Design“... • •Detekce infekčních nemocí, monitoring populací, záchrana ohrožených druhů, příbuzenské vztahy… • Základné metody •Štěpení NK •Polymerase chain reaction •Proby, hybridizace •Vektory, molekulární klonování •Microarrays •DNA sequencing •Elektroforetická separace NK • •Detekce genů: • *DNA: Southern blotting; inSitu hybridization; FISH Technique • *RNA: Northern blotting • *Protein: Western blotting, immunohistochemistry K purifikaci (extrakci) nukleových kyselin může být jako vstupní materiál použit: • krev • tkáň • bakterie • houby • živočišné buňky • rostliné buňky • exkrementy, vývržky • agarózové gely blood-concrete • typ vstupného materiálu • očekávaný výtěžek • věk vzorků • čas • finance • požadovaná kvalita Výběr použité techniky závisí pouze na nás… Všeobecný postup extrakce: 1.Digesce tkáně / lyze buněk 2.„chelátování“ a proteinázová fáze 3.Separace NK a proteinů 4.Pročištění 2. Chelating agents - Gets rid of divalent cations, Stops many enzymes from functioning. Proteinases - Break up and inactivate proteins and enzymes. Digesce tkání/ lyze buněk • narušit buňky nebo tkáně • vyhnout se metodám, které narušují DNA • • zvolená metoda závisí na typu buněk Příklady metod: • enzyme-based lyzozýmy • ultrazvuk • tekutý dusík • SDS-based narušení membrány QIAGEN DNeasy B&T kit 1.Použití Proteinase K • - rozkládá proteiny a inhibuje nukleázy 2.Lyze: Buffer AL (guanidium-HCl) • - hypertonický solný roztok 3.Vysrážení DNA s EtOH 4.Spin column - DNA se naváže na silica-membránu 5.Promytí 6.Eluce 1 (příp. 2), s teplým Bufferem AE (Tris-EDTA) 7. • 1.Proteinase K was named after the fact that it is good at digesting Keratin (i.e. hair). 3. EtOH much less polar than water. Final [EtOH] > 64% v/v ppts DNA. Because DNA is hydrophilic, alcohol (hydrophobic) is used to collect out DNA. 4. DNA binds to silica membrane at high salt and low pH conditions 6. DNA elutes from silica membrane at low-salt high pH conditions Je život fair? •1983 - Kary Mullis, vědec pracující pro Cetus Corporation řídil podél US Route 101 v severní Californii, když ho napadla myšlenka polymerázové řetězové reakce •1985 - metoda PCR byla představena vědecké komunitě na kongresu •Cetus odměnil Karyho Mullise $10,000 bonusem za jeho nápad •později, počas korporátní reorganizace Cetus prodává patent na PCR farmaceutické firmě Hoffmann-LaRoche za $300 millionů Život není fair! PCR: Amplifikace DNA •Často je k dispozici jen malé množství DNA –kapka krve –Vzácný typ buněk •V současnosti existují dvě metody pro amplifikaci DNA nebo tvorbu kopií • - Klonování—trvá dlouho, než dostatek klonů dosáhne požadovaného stupně kvality –PCR—funguje dokonce i na jediné buňce hned Co potřebuje PCR? • Templát (DNA, kterou testujeme) • Specifické primery pro studovanou oblast, forward a reverz • Polymeráza • Nukleotidy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) • Magnesium chloride (enzyme cofactor) • Buffer • Enhancer • Vysoce kvalitní DNA-free voda, minerální olej Všeobecné PCR podmínky •Magnesium chloride: 0.5-2.5mM • •Buffer: pH 8.3-8.8 • •dNTPs: 20-200µM • •Primery: 0.1-0.5µM • •DNA Polymeráza: 1-2.5 units • •Templátová DNA: £ 1 µg Kroky PCR •Denaturation 93 to 95°C 1min • •Annealing 50 to 55°C 45sec • •Elongation 70 to 75°C 1-2min Jak tedy probíhá PCR? • Horko (94oC) k denaturaci DNA dvouvláken • Zchlazení (54oC) k přisednutí primerů k templátu • Teplo (72oC) k aktivaci Taq Polymerázy, která prodlužuje primery a replikuje DNA • Opakování cyklu Denaturace 3’ 5’ Denaturace je první krok, kde se DNA rozpojí vlivem tepla Vodíkové můstky se přeruší a obě vlákna se oddělí 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Annealing •Annealing je proces vytváření vodíkových vazeb, kdy nasednou specifické primery na komplementární místo templátu •Probíhá při zchlazení na 55°C. •Čas potřebný k tvorbě nového vlákna je ca. 45 sekund (pro 1kb) 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Elongace •Taq polymeráza se váže k templátu a začne •připojovat volné nukleotidy komplementární •k původnímu řetězci •Probíhá to u 72°C jako optimální teplotě pro •TAQ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ PCR Review •Denaturace: 94°- 95°C •Primer Annealing: 40°- 65°C •Elongace DNA: 72° •Počet cyklů: 25-40 •Žádný cílový produkt se netvoří do 3. kroku •Po 30 cyklech je v roztoku 1,073,741,764 cílových kopií (~1×109). img07 PCR Primery • Primer je úsek NK, který slouží jako startovací místo replikace • • Je potřeba mít jak forwardní, tak reverzní primer, aby byla cílová sekvence tvořena simultánně v obou směrech Problémy s primery •Primery by měly ohraničovat cílovou část DNA sekvenci •Primery, které jsou komplementární k více místům, budou tvořit víc produktů •Primer může tvořit dimér se sebou nebo s druhým primerem •5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´ • |||||||||| • 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´ Primery, co tvoří hairpiny •Primery můžou mít komplementární oblasti v rámci sebe , tudíž budou tvořit tzv. hairpin • • 5´-GTTGACTTGATA • ||||| T • 3´-GAACTCT •3´ konec primeru se bude párovat uvnitř primeru a nebude reagovat s templátem PCR Taq DNA Polymeráza •Taq je odvozen z Thermus aquaticus, organizmu nalezeného v 176°F (80°C) horkých pramenech v Yellow Stone National Forest. •Taq DNA Polymerase (Taq Pol) je stabilní při vysokých teplotách a k činnosti potřebuje správnou koncentraci Mg •Optimum pro její fungování je 72°C Nevýhody Taq Pol •Taq Pol nemá 3’ to 5’ exonucleázovou aktivitu přítomnou u jiných polymeráz • Taq špatně zařadí 1 bázi v 104. •u 400 bp cílové sekvence bude chybovost v 33% molekul po 20 cyklech • Jak předejít problémům? •Pfu DNA Polymeráza z Pyrococcus furiosus má 3' to 5' exonucleázovou aktivitu •Chybovost je pouze 3.5% po 20 cyklech •Po přidání většího množství primeru lze předejít dimérům •Pro neznámé geny lze použít primery příbuzných druhů Limitace PCR •Jsou potřebné informace o cílové sekvenci • design primerů pro neznámé • známé hraničné oblasti •Chybovost při DNA replikaci • Taq Pol – Error 40% po 20 cyklech •Krátka délka a omezené množství produktu • do 5kb je lehko amplifikovatelný produkt . • do 40kb je amplifikace s modifikacema možná • nelze amplifikovat geny >100kb • nelze použít v projektech sekvenování genomu Design PCR primerů •Sekvence primerů by měly být unikátní •Sekvence primerů by měly být ~20 bazí dlouhé •Obsah G/C by měl být 45–55%. •Annealingová teplota by měla být podobná •Na 3´-konci by měly být G nebo C. •Nesmí mít self-komplementární oblasti nebo vytvářet hairpiny •Nesmí mít repetitivní oblasti Výhody PCR •Rychlost •Snadné použití •Citlivost •Robustnost Agarózová gelová elektroforéze •Elektroforeze je způsob separování molekul na základě rychlosti jejich pohybu v gelu v elektrickém poli dna-gel DNA_bbone DNA má negativní náboj díky cukrofosfátové kostře • DNA putuje od černé negativní elektrody (katody) k pozitivně nabité elektrodě (červená) - anodě Agaróza • Polymerizací vytvoří pevný gel, který je pórovitý a umožňuje pohyb DNA • Krátke DNA fragmenty prochází gelem rychleji než dlouhé img80 D-galactose 3,6-anhydro L-galactose SEM agarózy agarose and buffer 2 Agarózový gel se připraví smícháním a.prášku a pufru Agaróza TBE Buffer Erlenka k přípravě all equiptment Electrophoresis Equipment casting tray3 flask1 flask2 melted1 unmelted1 Ethidium Bromide 800px-EtBr2 Mutagen! Interkaluje se do NK a emituje světlo po ozáření UV světlem pour1 unmelted gel1 solid gel1 gel in box1 Place the gel in the electrophoresis tank (aka gel box). Katoda (-) Anoda (+) gel in trey w buffer TBE buffer è Add enough 1x TBE buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer. 6X loading dye 6X Loading Buffer: · Bromfenolová modrá · Glycerol Nanášení vzorků PCR produkty se smíchají s nanášecím pufrem – obarví je a zvýší denzitu – zabrání vyplavení vzorku z jamky gel loading1 Loading the Gel Carefully place the pipette tip inside a well and gently/slowly expel the sample. The sample should sink into the well. gel box cover Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes wires in the electrophoresis chamber. power supply on Running the Gel early run ß jamky ß Bromfenolová modř katoda (-) anoda (+) DNA (-) â …a pod UV světlem 1 2 3 4 ap0091_fig2 2.0 0.6 • ‘Nikdy nevyhazujte vzorky před koncem experimentu.’ • • •Hledaní v odpadu není nic moc! dumpster-diving Zdroj: www.flickr.com/photos/50262392@N00/45684291 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) •Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) je technika, kterou jsou organizmy odlišovány analýzou vzoru rýhování DNA • • • • • RFLP •Základním způsobem detekce RFLP je fragmentace DNA restrikčními enzymy, které rozpoznají specifické místo na DNA. Výsledné DNA fragmenty jsou pak separovány dle délky pomocí elektroforézy a přeneseny na membránu technikou Southern blot • • Tvorba fragmentů Arber, Nathans and Smith – Nobelova cena (1978) •Restrikční endonukleázy jsou základem molekulární genetiky, genetického inženýrství a rekombinantních DNA technologií •Několik typů – nejčastější Eco R I HIND III • • • • Co je blotting? •Bloty jsou technikou přenosu DNA (Southern), RNA (Northern) nebo proteinů (Western) na nosiče, aby mohly být separovány pomocí elektroforézy •Hybridizace radioaktivní sondy na filtraci navázané NK je nejinformativnějším experimentem v molekulární genetice 100_0167 Organizační diagram Blotting technique Southern Blot K detekci DNA Northern Blot K detekci RNA Western blot K detekci proteinů TYPY BLOTTING TECHNÍK • Sir Edwin Southern, Profesor Biochemie •Vyvinul svou metodiku r. 1975. • Professor Sir Edwin Southern Profesor Sir Edwin Southern Southern Blot working protocol Využití Southern blottingu •Objevování a mapování genů, evoluční a vývinové studie, diagnostika a forenzní studie •Definitivní potvrzení u GMO o úspěšné inkorporaci inzertu do hostitelského genomu •Předpovědi rakoviny v prenatální diagnostice genetických onemocnění