PCR real-time PCR Sekvencování DNA Fig1 DNA PCR product cloned fragment - + laser beam detector capillary electrophoresis G C G A G C T Sanger tools_1a Sekvenování PCR produktu: – jen jeden primer - vysoká koncentrace templátu (hodně kopií) AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F -OH 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C Sekvenační „PCR“ – jen jeden primer AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAG-OH 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C 3. Polymerizace - 72°C Přisedání deoxynukleotidů ... AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGTCAGTC=O 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C 3. Polymerizace - 72°C Přisedání deoxynukleotidů ... ... až narazí na dideoxynukleotid Sekvenační „PCR“ – jen jeden primer TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C 3. Polymerizace - 72°C 35 x Primer - F - AAGTCAGTC=O Sekvenační „PCR“ – jen jeden primer TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGT=O 1. Denaturace - 96°C 2. Nasednutí primeru - 50-60°C 3. Polymerizace - 72°C 35 x Primer - F - AAGTCAGTC=O Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O Sekvenační „PCR“ – jen jeden primer Primer - F - AAGTCAGTC=O Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O Primer - F - AAGT=O ... a řada dalších fragmentů, každý z nich označený fluorescenčním dideoxynukleotidem Kapilární elektroforéza - seřazení fragmentů podle délky - detekce barvy dideoxynukleotidů Výsledek sekvenační „PCR“ Detekce fragmentů – kapilární elektroforéza TTCAGTCAGATTTACGCTAACCCT Rev. Primer - F Primer - R Primer - F - AAGTC=O Primer - F - AAGTCAGTCTA=O Primer - F - AAGTCAGTCTAA=O Primer - F - AAGTCA=O Primer - F - AAGTCAGTCT=O Primer - F - AAGTCAGTC=O Primer - F - AAGTCAGT=O Primer - F - AAGTCAG=O - + Fig1 AAGTCAGTCTAAATGCGATTGGGA Primer - F Rev. Primer - R krátké -------------- dlouhé (rychlé) ------------ (pomalé) Genotypizace – stanovení genotypu •stanovení formy (alely, haplotypu) určitého úseku DNA („genetického markeru) • 1)izolace celkové DNA z tkání 2)amplifikace požadovaného úseku DNA (PCR-based methods) 3)studium variability daného úseku (lokus = marker = znak) 4) Typy genetických markerů Př.: chromozóm 1 „single-locus“ „multi-locus“ Typy genetických markerů •dominantní markery – odliší pouze přítomnost (či nepřítomnost) daného znaku; tj. neodliší obě jeho formy na homologních chromozómech • •kodominantní markery – identifikace homologních alel, tj. je možno rozlišit homozygotní a heterozygotní stav (umožňují stanovit frekvenci alel) Typy genetických markerů Single locus Codominant PCR assay Overall variability Nuclear multilocus Minisatellite DNA fingerprints No No No High RAPD No No Yes High AFLP No No Yes High Nuclear single locus Alozymy Yes Yes No Low-medium Mikrosatelity Yes Yes Yes High SINE (LINE) Yes Yes Yes Low SNPs (sekvence) Yes Yes Yes Low-high Single-locus genetic markers •kodominantní – možno stanovovat frekvence alel (= lze odlišit homo- a heterozygota) • •allozymy a jiné funkční geny - MM • •mikrosatelity – délkový polymorfismus • •SNPs (single nucleotide polymorphisms) – sekvenční polymorfismus • •SINE, LINE – inzerce (tj. délkový polymorfismus) Mikrosatelity Mikrosatelity jsou a budou stále velmi užitečné markery v molekulární ekologii Mikrosatelity •VNTR („variable number of tandem repetitions“), SSR („simple sequence repeats“) •jednotlivé alely se liší délkou • TTCAGGCACACACATCTCTAGCTTCGA 27 bp TTCAGGCACACATCTCTAGCTTTGA 25 bp genotyp diploidního jedince: 25/27 Mikrosatelity •1-6 (nejč. 2-4) bp motiv •početné po celém genomu •vysoká úroveň polymorfismu (běžně 15 alel v populaci) •Mendelovská dědičnost (autosomy) - kodominance •ideální pro studium populační struktury a příbuzenských vztahů Mikrosatelity - postup analýzy • •Izolace DNA • •PCR • •Detekce → gelová elektroforéza • → sekvenátor (fragmentační analýza) CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT tools_1a lox8uka gelloadingphoto lox8uka pcr pahylkresleny CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTT GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAA primer primer GAAAGAAAGAAAGAAA primer primer elektroforéza: agaróza (20 bp) → PAGE (4 bp) → kapilára (1 bp) tools_1a detektor laserový paprsek Kapilární eletroforéza ~ Fragmentační analýza Msat paternita - Sekerak směr elektroforézy Stanovení délky PCR fragmentů srovnáním se známým standardem (ten je označen jinou fluorescenční značkou než PCR produkt) krátké -------------- dlouhé (rychlé) ------------ (pomalé) ROX – Size standard NED – studovaný znak 300 bp 350 bp 340 bp 326.66 bp 342.61 bp Genotyp mikrosatelitu na lokusu NED = 326/342 nebo 327/343 Čas 298 304 302 294 296 „stutters“ – chyby v důsledku „sklouznutí“ polymerázy při PCR - často odlišují mikrosatelity od nespecifických PCR produktů - rozdíl mezi alelou a „stutter“ je délka repetice (zde 2 bp) Genotyp 298/304 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT - alely a jejich stuttery jsou černě (rozdíl mezi nimi je 2 bp) - bílé píky jsou tzv. „mínus A-alely“ a jejich stuttery = výsledek jiné chyby polymerázy, a to nepřidání koncového adeninu - rozdíl mezi černým a sousedním bílým píkem je 1 bp (tj. chybějící adenin) - pattern daného lokusu je vždy specifický a často záleží na PCR podmínkách 162 174 173 171 169 161 159 157 172 170 160 158 Genotyp 162/174 Srovnání různých jedinců – analýzy příbuznosti Msat paternita - Sekerak Elektroforetogramy čtyř různých heterozygotů 3 bp repetice PCR produkty 125-134 bp + - Ind. 1 Ind. 2 Ind. 3 Ind. 4 směr elektroforézy 125/131 131/134 125/134 131/137 Př. Analýza příbuzenských vztahů Msat paternita - barvy Genotyp (bp) Matka: 125/131 Otec: 131/134 Potomek 1: 125/134 Potomek 2: 131/137 Sledovaný otec mohl zplodit potomka 1, ale zcela jistě není otcem potomka 2 + - ? Různé značení různých znaků • •Snížení časových a finančních nákladů •= „multiplex set“ •Až 4 různé barvy (+ 5. barva jako velikostní standard) – analýza až 4 lokusů o stejné velikosti alel • 3LOKCELE Lokus 1 Lokus 3 Lokus 2 Mikrosatelity - omezení •nalezení lokusů (navržení primerů) je pracné a nákladné u volně žijících druhů (genomová knihovna, klonování, screening, sekvencování) TTCAGGCACACACATCTCTAGCTTCGA Př.: chromozóm 1 „flanking regions“ – ohraničují repetici a zde musí být navrženy primery pro PCR Restriction, enrichement, cloning, and sequencing Genomic DNA after restriction and enrichement sequencing of inserts (repetitive DNA + flanking regions primer design and polymorphism testing isolation of vectors containing inserts screening for repetitions by hybridisation Každý klon obsahuje jednu sekvenci vector = plasmid Enriched genomic library ligation, transformation Mikrosatelity - omezení n„cross-amplification“ – úspěšnost klesá s fylogenetickou vzdáleností n nnulové alely (mutace v primerových sekvencích) → vyšší proporce „homozygotů“ TTCAGGCACACACATCTCTAGCTTCGA TTCAGGCACACATCTCTAGCTTTGA x PCR OK no PCR Mikrosatelity – budoucnost (?) n„next-generation sequencing“ – velice rychlá sekvenace stovek tisíců fragmentů z jakéhokoliv genomu n nvyhledání repetitivních sekvencí vhodným softwarem a navržení primerů n nidentifikace nových mikrosatelitů rychle, elegantně a relativně levně (1500 EUR) Teoretické mutační modely – analýzy vyžadující údaj o podobnosti alel Dva extrémy •IAM – infinitive allele model Při mutaci ztráta nebo získání libovolného počtu opakování. Vzniká nová alela, která doposud v populaci nebyla - každá alela vznikne pouze jednou a pak už se nemění. Není možno určit podobnost (similarity) alel • • •SMM – stepwise mutation model (Mutace způsobeny pouze ztrátou nebo získáním jediného opakování motivu. Mutací může vzniknout alela, která je již v populaci přítomna – tzv. homoplázie. Je možno odhadnout podobnost alel. CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT Indels •inzerce nebo delece 1bp či delších úseků – použití pouze pro modely vyžadující „identity“ (nepoužitelné pro modely vyžadující „similarity“ TTCAGGCACACACATCTCTAGCTTCGA TTCAGGCACACACACATCTCTAGCTTCGA SMM model – možno kvantifikovat podobnost alel 27 bp 27 → 29 bp TTCAGGCACACACATCTCGTAGCTTCGA TTCAGGCACACGACATCTCTAGCTTCGA TTCAGGCACACCATCTCTAGCTTCGA TTCAGGCACACACATCTCTAGTTCGA 27 → 28 bp 27 → 28 bp 27 → 26 bp 27 → 26 bp „Indels“ – pouze pro analýzy, kde je vyžadována „identity“ a nikoliv podobnost Proč je tolik alel? (microsatellite instability) • • •Nerovnoměrný (Unequal) crossing-over (díky špatnému alignmentu) • • •Sklouznutí polymerázy při replikaci Slip-strand mispairing (při replikaci nejprve polymeráza sklouzne a vyrobí odlišný počet opakujícího se motivu mikrosatelitu, při alignmentu je pak část opakování vykloněna mimo dvoušroubovici, flanking regions tedy párují) Bias (skutečná data) •Kratší mikrosatelity (s malým počtem opakování motivu) mají zřejmě tendenci se spíše prodlužovat (slabě převládají adice nad delecemi) • •Delší mikrosatelity se spíše zkracují (náchylnější k velkým delecím) • •Delší mikrosatelity rychleji mutují (díky více opakováním je vyšší pravděpodobnost pro sklouznutí polymerázy (SSM) – mají více alel) Mikrosatelity - závěry •Mechanismy evoluce mikrosatelitů stále nepříliš objasněny • •Stepwise mutation model SMM platí jen omezeně • •= nevýhoda v populační genetice (jsou rychle nahrazovány jinými markery, např. SNPs) • •= tolik nevadí při identifikaci jedinců a analýzy příbuznosti (paternity) SINE, LINE, etc. (Shedlock et al. 2004, TREE; Ray et al. 2007, MolEcol) •Transposable elements • •Vytváří kopie (většinou) • •Kopie integrovány na nová místa v genomu • •Obvykle nejsou specificky odstraňovány • •Molekulární fosílie – neexistují homoplasie !!! • •Nesmírně početné • •Člověk – víc jak polovina genomu (ost. druhy – 40-90%) • Objev DNA transpozonů u kukuřice: Barbara McClintock Barbara McClintock, 1947 Barbara McClintock Typy transposabilních elementů •Kódující své proteiny, autonomní, 1-10 kb –DNA transposony (cut-and-paste) –transposasa –Retrotransposony (copy-and-paste) –LINE 1-2 proteiny, kopie přes RNA –LTR retrotransposony 5-6 proteinů, také přes RNA – •Nekódují proteiny, neautonomní, 100-1000 bp paraziti předešlých, např. SINE (člověk Alu – více než 1 milion kopií) – nejčastěji používané v populačních a fylogenetických studiích • • LINE – mechanismus transpozice •Kopie přes RNA • •Reversní transkriptáza • •Mašinerii využívají SINE (jsou to „paraziti“), Alu (SINE) a L1 (LINE) se stejně rychle množí DNA RNA Zpět na DNA Nové místo v genomu • LTR retrotransposony – opět přes RNA, složitější proces Velmi nízké riziko homoplázií → SINE = ideální fylogenetické markery „single-locus marker“ - PCR amplifikace daného úseku a elektroforéza SINE Neexistují zpětné mutace = výhoda oproti sekvenačním datům Příklad aplikace: kytovci vs. sudokopytníci (hroch je bratr velryby)