20.9.2012 9-10.50hod Doc. Paleček Úvod –historie, význam 27.9.2012 9-10.50hod Doc. Paleček Metody kultivace, detekce, způsoby analýzy 4.10.2012 9-10.50hod Doc. Paleček Genetické a molekulárně biologické metody 11.10.2012 9-10.50hod Doc. Paleček Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces, 18.10.2012 9-10.50hod Doc. Paleček Regulace transkripce, lokalizovaná exprese , hybridní systémy 25.10.2012 9-10.50hod prof. Svoboda Sekreční dráhy a endocytóza 1.11.2012 9-10.50hod prof. Svoboda Protoplasty kvasinek jako modelový objekt 8.11.2012 9-10.50hod prof. Svoboda Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty 15.11.2012 9-10.50hod Doc. Paleček Organizace chromatinu a oprava DNA 22.11.2012 8-12hod A7 prof. Svoboda+Doc.Paleček - Cvičení k přednášce 29.11.2012 8-12hod A7 prof. Svoboda+Doc.Paleček - Cvičení k přednášce 6.12.2012 10-11.50hod A7 prof. Kopecká O podstatě buněčných stěn kvasinek 13.12.2012 8-12hod Doc. Paleček Zkouška Otázky k předchozí přednášce? Souhrn 1. přednášky •Kvasinky - historie •Výskyt a přenos •Vztah k lidskému zdraví •Význam pro biotechnologie a výzkum Osnova 2. přednášky •Základní charakteristiky kvasinek •Podmínky růstu •Morfologie buňek a kolonií •Identifikace a analytické metody Základní charakteristika kvasinek -Eukaryota – rostlinný systém – vyšší houby (1000 druhů) – rozdělení dle způsobu pohlavního rozmnožování (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) Basidiomycota Ascomycota Archiascomycotina Euascomycotina Saccharomycotina (Hemiascomycotina) Saccharomyces cerevisiae: › Eukaryota › Fungi/Metazoa group říše › Fungi (houby) › Dikarya oddělení › Ascomycota (vřeckovýtrusé) třída › Ascomycetes (vřeckovýtrusé) řád › Saccharomycetales (kvasinkotvaré) čeleď › Saccharomycetaceae (kvasinkovité) rod › Saccharomyces (kvasinka) TRENDS in Genetics 22 (2006) Přes značnou morfologickou podobnost vykazují kvasinky velké rozdíly v genomu: genomy (sekvence) kvasinek ze vzdálenějších větví fylogenetického stromu ani srovnat nelze Pivo, víno Chleba Lidský Patogen Využívá laktozu Rostlinný Patogen Halotolerant Lidský Patogen Využívá alkany Pivo Lidský patogen Fylogeneze kvasinek Srovnání průměrné % shody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata Vychází převážně z analýzy rDNA; nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. Většinou jednobuněčné organismy (+ hyfy, + kolonie) Nejčastěji kulaté až oválné (3-15 mikrometrů) Množí se většinou pučením (+ jedině rod Schizosaccharomces: dělením - podlouhlé) Zpracovávají zdroje uhlíku kvašením (vyjímky Lipomyces ...) Srovnání průměrné % shody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata •% odlišnost sekvence proteinů: –S. cerevisiae a C. glabrata ~ člověk a ryba –mezi druhy S. sensu stricto ~ mezi řády savců –Proteiny člověka a hlodavců jsou si více podobné (lze rekonstruovat změny , jimiž genomy během evoluce od společného předka prošly) než proteiny druhů ze skupiny sensu stricto, mezi nimiž mohou vznikat životaschopné hybridy! Vychází převážně z analýzy rDNA; nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. •Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny • •volná voda (nikoli chemicky vázanou) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) •aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem a tlaku par destilované vody • • –0,95: Pseudomonas, Escherichia,…,většina bakterií –0,85: kvasinky (Candida, Torulopsis, Hansenula) –0,75: většina halofilních mikroorganismů –0,65: xerofilní plísně (Aspergillus) –0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry • •Bakterie vyžadují vyšší hodnoty aw (víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) •Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa … lze takto potlačovat i růst bakterií v kvasinkových izolátech) • •Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku – (aw=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) – rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPázové pumpy), •Lipomyces mají pouzdro – při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení • •Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %) nebo na 10% NaCl debaryomyces Debaryomyces hensenii Podmínky růstu - kyslík •- Většina kvasinek je fakultativně anaerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytné pro syntézu některých esenciálních metabolitů – ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) -fermentativní typy (S.c., S. p., rod Brettanomyces) - i v aerobních podmínkách fermentují (respirace i na glukoze představuje 10 % uhlíkového metabolismu) -respirativní typy (většina) – převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací •- obligátorně aerobní – nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu - neprodukují ethanol) – rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis • •- teploty, při nichž mohou kvasinky růst: • - mezofilní (0 – 48 °C) – většina druhů • - psychrofilní (-2 – 20 °C) – voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus, Candida) • - termofilní (ne méně než 20 °C) – potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyces) • •Maximální teploty, které některé kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C •Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. – rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), •teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), živiny •Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulozu … nebo methanol (Pichia pastoris), alkany apod.) •Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny • •Laboratorní podmínky: • •YPD/YES – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa)/u S.pombe supplements: A, H, L, U, K •Sabouraudův agar (1892) = 10g/l pepton, 40g/l dextrose (4%glukosa), 20g/l agar, pH 5.6 •Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) •Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2SO4, 1g/l KH2SO4, 0,5g/l MgSO4 .7 H2O, 10g/l glukosa, 1ml/l Wickerhamův roztok, 20g/l agar •Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) • Forsburg and Rhind, Yeast (2006) - Živiny určují morfologii/buněčnou formu – kvasinková nebo pseudohyfy nebo sporulace … - limitování klíčových živin spouští různé vývojové odpovědi - zdroje uhlíku a dusíku jsou monitorovány signálními dráhami Sporulace/meiosa Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) - Živiny určují morfologii/buněčnou formu – kvasinková nebo pseudohyfy nebo sporulace … - limitování klíčových živin spouští různé vývojové odpovědi - zdroje uhlíku a dusíku jsou monitorovány signálními dráhami fig75_3 Kvasinková forma - morfologie -za běžných podmínek (bohaté C i N zdroje) převládá kvasinková f. -rotační elipsoid, kulaté, protáhlé – rod Dipodascus až 130 mikrometrů -3-15 mikrometrů (bakterie -Haploidní spory vřeckovýtrusných kvasinek vzniklé při sporulaci diploidních buněk (pohlavní rozmnožování) Saccharomyces Schizosaccharomyces Lipomyces Hanensula Metschnikowia Nematospora -při nedostatku dusíku v kombinaci s ne-fermentovatelným uhlíkatým zdrojem dochází k indukci sporulace a meiosy - různé vývojové programy (formy) vedou k mnoho-buněčným strukturám - tvorba biofilmu na pevném podkladu se sníženým množstvím agaru (málo glukozy) - naopak tvrdý agar a UV záření indukuje „stopkování“ - různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy“ kolonie – kulaté a oválné buňky (S.c.) – není určující faktor - drsné kolonie – protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie – pouzdra (Lipomyces) - obvykle krémová barva – - červený pigment (Rhodotorula, Sporidiobolus) - černý pigment (melanin – Aureobasidium) - používá se např. pro odlišení C.d. od C.a. (kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C) Kolonie Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) rho1_L Kolonie Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) - různé vývojové programy (formy) vedou k mnoho-buněčným strukturám - tvorba biofilmu na pevném podkladu se sníženým množstvím agaru (málo glukozy) - naopak tvrdý agar a UV záření indukuje „stopkování“ - různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy“ kolonie – kulaté a oválné buňky (S.c.) – není určující faktor - drsné kolonie – protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie – pouzdra (Lipomyces) - obvykle krémová barva – - červený pigment (Rhodotorula, Sporidiobolus) - černý pigment (melanin – Aureobasidium) - používá se např. pro odlišení C.d. od C.a. (kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C) Morfologie kolonii Stovicek et al, Fungal Gen Biol (2010) - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (… biofilm, flokulace) - závisí na FLO11 (adhesinu – glykoprotein – faktor důležitý pro flokulaci, biofilm, pseudohyfy) - závisí na ECM (extracellular matrix tj. glykoproteiny) - ECM zachycuje vodu a chrání kolonii před vyschnutím ECM Laboratorní kmeny jsou hladké (např. S288C - Genotyp: MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1) - tvořen matrix s mikrokoloniemi kvasinek, hyfami a pseudohyfami (komplexní struktura) - více rezistentní než planktonické buňky - významně přispívá k rozvoji a odolnosti kandidóz (rezistentní k antimykotickým látkám) - ECM a adhesiny/flokuliny FLO1, FLO11 jsou potřebné pro tvorbu biofilmu - váží např. peptidy na povrchu hostitelské buňky (C. albicans = ALS2, 3, 6, 7, 9 exprimovány při vaginální infekci zatímco ALS1, 2, 3, 4, 5, 9 exprimovány při orální infekci) - Biofilm Flokulace -reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, floky); odpověď na stres -flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci piva) • Smukalla a kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky … - Flo1p váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci – teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování Yeast surface display - hybrid Aga2 (aglutininy nebo Flo1 …) s testovaným proteinem - exprese eukaryotních proteinů v kvasince (podobné mechanismy … posttranslační modifikace) – knihovny lidských cDNA (i protilátek z pacientů) - využití i pro biotechnologie – vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) Pepper et al, CCHTS (2008) aglutinin - His-His-His-His-His-His (chelatuje Ni, Cu, Co kovy) -GTS1 transkripční faktor spouštějící aglutinaci pod CUP1 promotorem (další přednášky) - biosorbce & sedimentace Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) YSD - testy antigen/protilátka Boder et al, Arch Bioch Biphys (2012) - nabohacení i slabších interakcí Kvasinkové kolonie spolu „komunikují“ pomocí amoniaku – inhibuje růst sousední kolonie (kolonie S. cerevisiae produkují amoniak po 10 dnech růstu) Pálková et al., Nature 390 (1997) kolonie přesměrovává růst sousední kolonie – nekompetují o živiny - Aktivní inhibice růstu sousední kolonie nikoli (pasivní) důsledek spotřebování živiny Komunikace kolonií Čáp et al., Mol Cell, 2012 -větší buňky (4mm) -malé mitochondrie a vakuoly -více lipidových váčků - - rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů -menší buňky (3mm) -velké mitochondrie i vakuoly (aktivnější respirace a více ROS) - • Čáp et al., Mol Cell, 2012 rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů Differenciace S.cerevisiae v kolonii Čáp et al., Mol Cell, 2012 PIIS1097276512002663 U (upper) buňky - aktivní glutaminem-indukovanou TOR dráhu, sníženou respiraci (málo mitochondrii), AMK-sensing systém (Gcn4) a vyšší „turnover“ AMK (souvisí s produkcí amoniaku), produkují amoniak pro komunikaci kolonii - využívají živiny uvolněné z L buněk (autofagie) - jsou odolnější vůči stresu – déle přežijí - schopné proliferovat (po 10 dnech) L (lower) buňky – podléhají více stresu, hladoví (přestože jsou blíže mediu), aktivují degradační mechanismy (zásobují U buňky) Differenciace S.cerevisiae v kolonii Čáp et al., Mol Cell, 2012 PIIS1097276512002663 U (upper) buňky - aktivní glutaminem indukovanou TOR dráhu, AMK-sensing systém (Gcn4), sníženou respiraci - využívají živiny uvolněné z L buněk - jsou odolnější vůči stresu - schopné proliferovat (po 10 dnech) L (lower) buňky – podléhají více stresu, hladoví (přestože jsou blíže mediu), aktivují degradační mechanismy (zásobují U buňky) Killer toxiny •- Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda (výhoda pro vinaře – nepřerostou je cizorodé kmeny) -Poprvé pozorováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) -Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (různé skupiny ano) -Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles“ (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) – kódují obalové, replikační (ale potřebují buňku k replikaci …), transkripční sekvence a toxin -Samotné VLP nejsou infekční ani toxické (lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) -Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny (b-1,6-glukany) - způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně – ztráta iontů, potenciálu … buňka hyne - -Kluyveromyces lactis, Pichia membranifaciens – lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) -Hansenula mrakii … - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu b-1,3-glukanu (v místě růstu pupenu) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena P.m. -Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci – odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) -v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny C.a., C. podzolicus zabíjí C.n.) Santos et al., 2009, Microbiology •Určení (nových) kmenů v nových lokalitách • • • • • • • • •Určení kmene v klinických izolátech (odlišení patogenních kmenů Candida…) • • • • • • • •Kontrola čistoty kmene pro biotechnologické procesy (Saccharomyces cerevisiae – pivo)