Souhrn 2. přednášky •Základní charakteristiky kvasinek •Podmínky růstu •Morfologie buněk a kolonií Osnova 3. přednášky •Diagnostické metody •Analytické metody •Kvasinkové modelové organismy • • •Určení (nových) kmenů v nových lokalitách • • • • • • • • •Určení kmene v klinických izolátech (odlišení patogenních kmenů Candida…) • • • • • • • •Kontrola čistoty kmene pro biotechnologické procesy (Saccharomyces cerevisiae – pivo) Zpracování vzorků •- zpracování vzorků: • z půdy: promývání v destilované vodě → homogenizace → třepačka … • klinické vzorky stěrem nebo pomocí lepivé pásky … • a pak vysetí na Sabouraudův agar nebo YPD médium → kultivace 3-7 dní při teplotách 22-25 °C • • • • • •- identifikace/analýza: • fenotypové metody – morfologie kolonií, morfologie buněk, biochemické vlastnosti (fermentace cukrů, asimilace dusíkatých substrátů…), růst na chromogenních plotnách (Candida zelená) • • • •- moderní metody • PCR (nested, multiple, RFLP), • sekvenační (454 technologie), • hmotnostní spektrometrie • opsite C:\Documents and Settings\Administrator\Plocha\jm1080495001.gif (Hamal a spol. 2010: Postgraduální medicína) V klinické praxi je důležitější rychlost než přesnost (při zachování správné léčby) http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-mater ialu-prehled-soucasnych-moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847 Obr. 3 – Doporučená strategie identifikace kvasinek v laboratoři klinické mykologie http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-mater ialu-prehled-soucasnych-moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847 Jsou k dispozici komerční soupravy pokrývající určité kvasinkové druhy - rozdělení dle způsobu pohlavního rozmnožování (asko-vřecko, basidio-stopkovýtrusé a deuteromycetes; basidiosporogenní produkují ureasu – na močovině s fenolčervení se barví červeně …) - - Nejstarší sérologická souprava - Iatron Serological Candida Check Kit (Iatron Laboratories) - sklíčková aglutinace kandid (Kauffmann-Whiteovo schéma) - Komerční testy: identifikace C. albicans a C. dubliniensis - Bichro-Latex Albicans (Fumouze Diagnostics) - test klíčních hyf, C. albicans přímo z pozitivních hemokultur - ELITex Bicolor albi-dubli (ELITech Group) Bichro-Dubli - rychlá detekce C. dubliniensis (vyšší rezistence k azolovým antimykotikům), ELITex dubliniensis Orientační metody Kombinace (mikromorfologických, biochemických …) parametrů: - - Morfologie – rozlišení jednotlivých druhů. Charakteristika tvaru, velikosti, povrchu…, asexuální a sexuální struktury,… teplotní studie…. Campanha et al., 2005, Oral DIseases Podrobné metody C. dubliniensis: nadbytek chlamydospor na koncích krátkých pseudohyf C. albicans: na delších hyfách či pseudohyfách jen jedna terminální chlamydospora > Např. odlišení C.d. od C.a.: 24h kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C (a) C. dubliniensis (b) C. albicans Mikromorfologie - Kolonie Biochemické testy –- Biochemické parametry – založeny na schopnosti utilizace uhlíkatých látek (cukrů), utilizace dusíkatých látek (hydrolýza močoviny), –(např. C. dubliniensis není schopna utilizovat D-xylózu, D-trehalózu, methyl-α-D-glukosid –chybí β-D-glukosidázová aktivita; C. albicans není schopna utilizovat glycerol) – chromogení substráty • Selektivně diagnostické kultivační půdy §„Zlatý standard“ – půda vyvinutá Rambachem - CHROMagar Candida (CHROMagar Microbiology, v ČR Colorex Candida od Trios) § předběžná identifikace čtyř druhů kandid: • C. albicans C. tropicalis • C. crusei C. glabrata Obr. 2 – Orientační identifikace kvasinek na selektivnědiagnostické půdě CHROMagar (a – Candida albicans, b – Candida tropicalis, c – Candida krusei, d – Candida glabrata Molekulární taxonomie -konvenční taxonomie je problematická : - morfologie kvasinek není stabilní→ roztěr a nárůst trvá několik dní (prodlužuje se včasná diagnóza …) - Většinu fyziologických, enzymatických … charakteristik lze zvrátit mutací (v jediném genu) - - - - - molekulární taxonomie (komerční účely - odlišit kmeny S.c.) - pulsní gelová elektroforéza (PFGE), FISH (karyotyp) - PCR, restrikční polymorfismus (odlišení druhů) - nejnověji MALDI-TOF (taxonomie) Þ - obtížná izolace DNA, proteinů … z kvasinek - je třeba nejdříve narušit silnou buněčnou stěnu … pomocí enzymů nebo mechanicky - poté PFGE nebo dále extrahovat DNA (např. fenol-chloroform, poté srážení etanolem) - specifické sekvence lze identifikovat pomocí Southern blotu nebo PCR - izolace DNA a štěpení restrikční endonukleázou -> agarozový gel -> přesátí na membránu -> sonda značená digoxigeninem (většinou se využívá sekvencí rDNA) Identifikace založená na odlišnosti typických sekvencí DNA Polymerázová řetězová reakce (PCR) denaturace nasedání prodlužování primeru řetězce primer termostabilní DNA polymeráza 25-35 cyklů v termocykleru 55°C, 30s 95°C, 30s 72°C, 1min/kb … thermocycler •1. sada primerů je universální kvasinková (pozitivní kontrola, vyšší proužky) a 2. sada primerů je druhově specifická (méně konzervovaný úsek DNA) - separace gelovou elektroforézou (barvení ethidium bromidem, UV transiluminátor) • • • • • • • • • • •po PCR může následovat štěpení restrikční endonukleasou a odlišení druhů na základě odlišné délky štěpných produktů (tzv. RFLP – restriction fragment length polymorfism) x x x Nested („zahnízděná“) PCR •amplifikace probíhá dvoufázově •v 1. fázi je pomocí jedné sady primerů namnožena delší sekvence nukleové kyseliny •takto získané amplikony jsou pak přeneseny do jiné amplifikační zkumavky obsahujících druhou dvojici primerů, specifických k vnitřní oblasti úseku amplikonů •konzervovaná intergenová oblast rDNA •detekce gelovou elektroforézou •eventuálně sekvenace •2 sady primerů, intergenová oblast rDNA Romeo et al., J. Microbiol Met 79 (2009) univerzální primer (konzervativní oblast 5.8S rDNA) Candida glabrata 397bp Candida nivariensis 293bp Candida bracarensis 223bp Multiplex PCR •Klasická elektroforéza dokáže rozlišit fragmenty pouze do velikosti 40-50kb (větší molekuly se pohybují stejnou rychlostí nezávisle na velikosti) •PFGE = pulse field gel electrophoresis (elektroforéza s měnícím se elektrickým polem, při změně směru elektrického pole trvá větším molekulám DNA déle, než se přeorientují - umožňuje separovat molekuly velké několik Mb ) •contoured clamped homogeneous electric field (CHEF) •gel obsahuje vzorky DNA uvnitř agarózových bločků (minimalizace náhodných zlomů velkých molekul DNA) • PFGE_animated PFGE Karyotypizace •S.c. kmeny mají podobný karyotyp – většinou se liší délkou chromosomu XII (podle počtu rDNA genů) •Průmyslové kvasinky jsou většinou polyploidní – homologní chromosomy mají odlišné velikosti •Srovnání kmenů pro fylogenetické účely (intaktní nebo RE naštěpené chromosomy) •Určení příbuznosti izolátů jednoho druhu pro epidemiologické účely např. kmeny z různých míst od jednoho pacienta, kmeny od 2 různých pacientů, kmeny od zdravotního personálu a pacientů 20 (A)Nekompletní naštěpení RE (B)Degradace nukleázy (C)Oprava přidáním 75 mM thiourey do pufru Sekvenování 800px-Sanger_sequencing_read_display Nová generace sekvenování Picture12-3 DSCN1366 300 000 jamek každá s jednou kuličkou obsahující jedno namnožené vlákno ssDNA enriched-bead Technologie 454 od firmy Roche Nová generace sekvenování Picture12-3 Technologie 454 od firmy Roche Picture13-1 Dojde k emisi světla vždy při zainkorporování komplementárního nukleotidu - nukleotid zainkorporován jako při PCR prodlužování řetězce avšak vždy je k dispozici pouze jeden nukleotid (4x opakovat – A C G T) 1.Destička se „fotí“ v čase po každém kroku T A C G T 2.Snímek každé jamky se skládá do sekvence flowgram_1790_203 3.Síla signálu odpovídá počtu zainkorporovaných nukleotidů A C G T AGCTATG… UPDATE CURRENT FLOW ORDER Studie populací S. cerevisiae a S. paradoxus •Sekvenace (+ hybridizace na čipech) > 100 kmenů z různých koutů světa •S. paradoxus – linie izolované podle lokalit • • • • • •S.cerevisiae - 3-4 původní linie, • které se díky člověku křížily … • Nature 458, (2009), p337 •hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry– MALDI-TOF) •Umožňuje odpaření a ionizaci netěkavých biologických vzorků z pevné fáze přímo do plynné • •Vzorek je smíchán s tzv. matricí • (v molárním poměru řádově 1:10-4) • •Směs se nanese na speciální kovovou • destičku a nechá zaschnout • •Destička se vloží do iontového • zdroje a ve vakuu je ozářena pulsním • laserem (UV) • •Energii laserového pulsu absorbuje matrice a předá ji molekulám analytu – odpaří se • • • C:\Users\Andrej\Desktop\maldi1.jpg MALDI-TOF • • • schema_maldi-tof-ms.gif ion vstupuje do vakua v trubici detektoru - z jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměr jeho hmotnosti a náboje (z doby letu částice) •MALDI-TOF hmotnostní spektrum je zobrazením četnosti ionizovatelných částic buněčného proteomu • •Charakter spektra závisí na krystalizaci a ionizačních vlastnostech vzorku à výška píku je rovna relativní koncentraci proteinu v místě ionizace • •Při srovnávání spekter druhů uvnitř rodu se hledají rodově charakteristické signály píků • •Identifikace na úroveň kmenů možná díky detekci charakteristických proteinů a peptidů • Anal Bioanal Chem 392, (2008), p. 439 •Techniky barvení –DNA/jádro – DAPI –aktinový – phaloidin –buněčná stěna – calcofluor –Endocytóza ->vakuoly – FM4-64 –Mitochondrie, ER - DiOC6 – (3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide) – – – – – – – – proteiny tagované GFP (in vivo) ncb041302 Figure Fluorescenční metody Elektronová mikroskopie - studium buněčné stěny … organel (sekrece …) více prof. Svoboda - šipky ukazují na jaderné póry - - vzorek „prosáknut“ epoxypryskyřicí a osmiem - „focused-ion beam scanning“ po 3nm TEM FIB - SEM Wei, et al., BioTechniques, 2012 • ER mitochondrie jádro cytoplasmatická membrána s invaginacemi http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00182/Cyzmmek_Supplementa_182027a.mpg Saccharomyces cerevisiae - oválné, množí se pučením – >diploidní i haploidní buňky - (rostou) většinou v G1 fázi (zatímco pombe je v G2 fázi) -Genom 12 Mbp na 16-ti chromosomech -Krátké centromery a ARS (100bp) -Kóduje cca 6 275 genů (5 800 je funkčních) -120 kopii rRNA, 262 tRNA -Geny reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní) -<5% genů obsahuje introny (0.5% genomu), 3% transposony (46% u člověka) Schizosaccharomyces pombe -podlouhlé, množí se dělením - většinou haploidní buňky -Pouze 3 kondenzované chromozomy (13 Mbp) -Velké repetitivní centromery (40-100kb) a 1kb počátky replikace -Má geny pro heterochromatin (S.c. nemá) -Asi 4800 kodujících genů (nejmeně u eukaryot) -z nichž 43% má introny -50 genů má homologie s geny lidských nemocí http://www.yeastgenome.org/ http://www.sanger.ac.uk/modelorgs/yeast.shtml http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/ Pichia pastoris •Metylotrofní kvasinka (schopná růst na metanolu jako jediném zdroji uhlíku) •Metanol je odbouráván v 1.kroku alkohol oxidázou (AOX1) •PAOX1 je silný promotor (5% celkové RNA) – represe glukozou a indukce •Podobné geny jako Saccharomyces cerevisiae (stejná nomenklatura, schopnost komplmentace) •10-100x vyšší exprese heterologních proteinů (až 30% celkového proteinu) •Vytváří kratší glyko řetězce (8-14 manosových zbytků – podbné vyšším eukarytům; S.c. 50-150 manosových zbytků - více imunogenní) Výhody kvasinkového modelu •Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy (90 min/dělení, 25-30°C) •Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování ploten, kapkovací test • =>toxiny v plotnách – HU, MMS …) •Stabilní haploidní i diploidní formy •Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty) •Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu (tetrádová analýza) •Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní) •Centromerické a multicopy plasmidy •Vysoká frekvence homologní rekombinace (lineární DNA) •Lze připravovat deleční a mutantní kmeny •Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“ • •Techniky barvení (např. aktinový cytoskelet = phaloidin, buněčná stěna = calcofluor ... + GFP in vivo) •Techniky synchronizace buněk • •S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA) •Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace) •EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid) •Mikročipy - expresní profily za různých podmínek • •Řada životních dějů má analogii v procesech v savčích buňkách • (lidské geny testovány v kvasinkách - nemoci, metabolismus, •regulační mechanismy) 80J_3