Souhrn předchozích přednášek (relevantní pro tuto přednášku) •Buněčný cyklus S.c. a S.p. •Metodika analýzy kvasinek •Genetické metody • • Osnova 7. přednášky •Dynamika chromatinu –v buněčném cyklu – organizace: centromery, telomery – SMC komplexy •Evoluce kvasinkového genomu • • Saccharomyces cerevisiae (vs S.p.) - haploidní genom - 12Mbp, 16 chromosomů (chrI=0.22 – chrXII=1.6Mbp) - délka chromosomu XII se u různých S.c. liší dle počtu (až 200) kopii rDNA v repetici (9kbp), 262 tRNA, 40 snRNA, - Krátké centromery a ARS (100bp) - Geny (cca 6500) reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní) - Redundantní (2000 genů duplikováno) – cca30% genomu vzniklo duplikacemi - <5% genů (220) obsahuje introny (0.5% genomu), - 3% Ty1-5 transposony (46% u člověka) - Kondenzovaný/tichý heterochromatin: centromery, telomery a HMR/HML Základní prvky kvasinkového genomu chrIII Chromosom III CEN=centromera ARS=autosomal replicating sequence TEL=telomery tRNA Ty transposony MAT a HML/HMR lokusy Heterochromatin: centromera telomery HMR a HML (MAT je aktivní určuje haplotyp) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5213-5218. Pozorování DNA/chromosomů u kvasinek •Chromosomy jsou u kvasinek malé a těžko pozorovatelné – barvení DNA na fixovaných preparátech pomocí DAPI (4 ,6-diamidino-2-phenylindole) •Použití fůzních proteinů-GFP (green fluorescence protein) pro studium dynamiky chromatinu (H2A, kinetochora-centromera) •TetR-GFP represor se váže na TetO sekvence (operon) zaintegrované v přesně definovaném lokusu •ChIP (chromatin immune precipitation) – specifické sekvence, ChIP-seq nebo „ChIP on CHIP“ DAPI Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Pozadí = mtDNA -zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze tj. replikace -rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze -jádro se protahuje – začátek M fáze (u kvasinek se jaderná membrána nerozpadá) -na začátku anafáze dochází k oddělení sesterských chromatid a jejich segregaci - SPB-GFP barvení Actin_2 DNA v průběhu buněčného cyklu S.cerevisiae MT-cytoplasmatické -jaderné Image courtesy of Jonathan Millar, Division of Yeast Genetics, National Institute for Medical Research, London Separace a segregace chromosomů (centromera-kinetochora=Ndc80-GFP + SPB=Cdc11-CFP) • sce04111 Kontrola buněčného cyklu (S. cerevisiae) mutanty cdc … KEGG pathways cut14-208 mutant (kondensin) cut defekt: - chyba v koordinaci mitózy (např. spindle attachment) - chyba v segregaci chromosomů (např. kohesiny) Yanagida, Phil Trans of RS, 2005 Nakazawa et al, JCS, 2011 http://jcs.biologists.org/content/suppl/2011/05/14/jcs.078733.DC1 WT (H2A-RFP in vivo) Yanagida, Phil Trans of RS, 2005 Kontrola buněčného cyklu (S. pombe) Mad2 mis cut v cut14 mutantě jsou defekty v kondensaci a segregaci, ale checkpoint není aktivován Centromera S. pombe Aurora Kinesin - kontrola interakce mezi MT a CEN - kondenzované chromozomy - geny pro heterochromatin (HP1, metylace …) stacks_image_556_1 - pouze 3 chromozomy (13 Mbp = 3.5, 4.6, 5.7) - velké repetitivní centromery (40-150kb) a 1kb počátky replikace Reinhardt a Bartel, Science, 2002, http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/main7.html Carroll a Straight, Trends in Cell Biol, 2006 Centromera S. cerevisiae Chan et al., Trends in Cell Biol, 2005 Konsensní skevence kvasinek - Sekvenčně specifická centromera se patrně vyvinula z původně repetitivní/sekvenčně nespecifické > Orientace chromosomů v mitotickém jádře 1747-1028-2-17-2 FISH – fluorescence in situ hybridization (1992) Tadei a Gasser, Genetics, 2012 rDNA (repetice) Struktura kvasinkových telomer Lowell et al., Cell Mol Life Sci (1998), p.32 300bp Repetice ~5.5kbp Telomery umlčují transkripci – ADE2 reporter je pod kontrolou telomer pouze občasně náhodně transkribován Cohen et al., Curr Genetics (1998), p.83 E. Blackburn, Nobelova cena, 2009 Ochrana kvasinkových telomer - musí být prodlužovány (telomerásou), jinak by se zkracovaly po každé replikaci - musí být chráněny, jinak by byly považovány za konec zlomené DNA („opraveny“ např. fůze chromosomů) - struktura telomer a subtelomer umlčuje transkripci (silencing) - S. pombe vs S. cerevisiae (heterochormatin se Swi6 vs Sir proteiny) Represe u kvasinkových telomer - struktura telomery a subtelomery umlčuje transkripci (silencing) -např. HML a HMR lokusy jsou umlčené (pouze MAT lokus určuje párovací typ) - ADE2 reporter je pod kontrolou telomer pouze občasně náhodně transkribován - v průběhu evoluce některé geny mění lokalizaci a jsou jinak regulovány rDNA - repetice •rDNA kóduje geny pro ribosomální RNA (chromosom XII) •Je vysoce konzervativní •Identifikace a odlišování kvasinkových druhů •Sledování evolučních trajektorii •Až 200 kopii v řadě za sebou •Problém s homologní rekombinací •Problém s replikací – ve stejném směru jako • transkripce (probíhá v S-fázi – kolize) Komplexy chromatinu • - nukleosom (oktamer histonů H2A, H2B, H3, H4) - Topoisomerasa II, SMC komplexy kohesin – smyčky, dceřiné chromatidy kondensin – kondenzace pro mitozu SMC5-6 – oprava DNA - -DNA je v jádře ve formě kondenzovaných struktur -Vyjádření genetické informace je ovlivněno mnoha faktory - regulace transkripce, buněčný cyklus … Model separace chromosomů (S. cerevisiae) APC=anaphase promoting complex Uhlmann et al., Nature, 1999 kohesinový komplex (SMC=structure maintenance of chromosome) SMC1, SMC3, Scc1 a Scc3 Separasa-securin malé chromosomy – TetO na různá místa - TetR-GFP (segregace) Použití TEV proteasy Kohesin „objímá” DNA Haering et al, 2002, Mol Cell SMC1 Scc1/Rad21 SMC3 Scc3 Použití fůzních proteinů při studiu kohese sesterských chromatid SMC3-Scc1-Frb + SMC1-FKBP12 (váží rapamycin) Gruber et al., Cell, 2006 Vstup DNA přes opačný konec než uvolnění Gruber et al., Cell, 2006 Uzamčení je pro buňku letální Full-size image (60 K) Smc5 Smc6 ? SMC komplexy napomáhají při opravě dvou-řetězcových zlomů v G2/M fázi Lowdens a Toh, Current Biology, 2005 Centromera DSB Yanagida, Phil Trans of RS, 2005 Oprava DSB (dvouřetězcové zlomy) • Lisby a Rothstein, DNA repair, 2009 G1 G2/M delece … Každý DSB je nebezpečný pro buňku. Základní mechanismy opravy DSB, společné pro S. c. a S. p. (evolučně vzdálené), lze nalézt i … u člověka • sce04111 Kontrola buněčného cyklu (S. cerevisiae) mutanty cdc … KEGG pathways Kolodner et al, Science (2002) Základní mechanismy kontroly buněčného cyklu, segregace, opravy DSB jsou konzervované od kvasinek až po člověka … Problémy se segregací či opravou poškozené DNA mají konsekvence … aneuploidie … rakovinné bujení … ale také důležitý faktor v evoluci … cca 30% genomu S.c. vzniklo duplikacemi => cca 2000 genů duplikováno nebo došlo k celogenomové duplikací (WGD) => a poté došlo k přeskupování a redukci segmentů (i chromosomů) – 30% genomu u S.c. je pozůstatkem celogenomové duplikace (nikoli duplikace segmentů či genů) Celogenomová duplikace – S.cerevisiae Ancestrální chromosom Evoluce kvasinkového genomu •srovnání kvasinkových genomů ukázalo na existenci „prakvasinky“ s 8-mi ancestrálními chromosomy (cca 4500 geny) •nejblíže anc. genomu je Lachancea kluveri (8 chromosomů, nejméně = 15 přeskupení v genomu) • Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 • ancestrální kvasinka prošla celogenomovou duplikací (WGD) 8->16 chromosomů • • •některé kvasinky některé chromosomy ztratili (např. C.glabrata = 3 chromosomy) Přeskupování chrom. bloků u L.kluveri Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 • přeskupení prostřednictvím rekombinace (mikrohomologií) • • • L.k. neztratil chromosom - patrně způsobeno absencí genů DNL4, POL4, NEJ1 – důležité pro NHEJ mechanismus (oprava poškozené DNA např. dvouřetězcových zlomů, které jsou nutné pro fůze chromosomů i přeskupovaní => omezené přeskupování) Redukce chromosomů telomera-telomera fúzemi •např. Zygosaccharomyces rouxii ztratila 1 chromosom díky telomera-telomera fůzi 2 ancestrálních chromosomů - současně ztratily centromeru (chromosom nemůže mít 2 centromery – problémy se segregací) Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 Závěry •Kvasinky jsou využívány v biotechnologiích (pivo…) •V klinické praxi mohou být nebezpečné pro pacienty se sníženou imunitou … •Jako modelový organismus •studium buněčných procesů •Genetické, evoluční … analýzy