ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR V. Návrh primerů a sond Hybridizace • Úspěšný annealing sondy a primerů je kritický předpoklad úspěšné PCR − Sekvence − Koncentrace solí − Tvorba heterodimerických stabilních struktur − Párování bazí - nejen Watson a Crick − Sekundární struktura − Teplota tání DNA Tm Design primerů a sond • jeden z nejdůležitějších parametrů, determinující annealingovou teplotu • Tm – teplota, při které je 50% daného oligonukleotidu denaturováno • „cooperativní melting“ – usnadněná denaturace po disociaci prvního páru bazí • Sekvence: AT GC • Rychlost renaturace (a tedy i Tm) přímo úměrná délce řetězce a jeho koncentraci a nepřímo úměrná komplexitě molekuly (struktura) • Elektrostatické interakce mezi fosfátovýnmi molekulami • kationty maskují + náboje fosfátů - vyšší iontová síla vede k vyšší Tm Oligonukleotidy kratší než 20bp Tm = 2 x (A+T) + 4x (G+C) Iontová síla, %GC a délka řetězce (N) Tm=81,5+16,6 (log10[Na+]+0,41(%GC)-(625/N) Web-based kalkulátory Melting temperature Tm http://insilico.ehu.es/tm.php Design primerů a sond Melting temperature Tm Design primerů a sond Gibbsova (volná) energie a její změna (G, G0) •Schopnost látek jít do reakce •Sekundární struktura DNA • G závisí na změně vnitřní energie a entropie • Změna volné energie G0 (množství energie uvolněné nebo absorbované během reakce za stejné teploty a tlaku) - spontánní reakce - G<0 • Znalost termodynamického příspěvku párování bazí, mismatches, volných konců, vlásenkových struktur a smyček – predikce parametrů hybridizace • Predice sekundární struktury – nearest neighbor - helix initiation factor (GC/AT) - helix propagation energie nutná pro vytvoření následujícího hybridizačního páru - symetrie sekvence (duplexu) - Loop regions – smyčky, vlásenky, výdutě atd. Design primerů a sond 1. Počet odpovídajících párů bazí - Kombinace vodíkových můstků a hydrofobních interakcí - Pozice a typ neodpovídajícího páru (mismatch) 2. Sekvence – nearest neighbor 3. Sekundární struktura - Charakter cílové sekvence - Kompetice primeru nebo sondy s komplementárním řetězcem cílového duplexu 4. Volné konce - Interakce mez 5’ a 3’ konci hybridizovaného oligonukleotidu a nejbližší sousedící báze - Příklad: G0 (GC) -0,96kcal/mol G0 (AT) -0,50 kcal/mol G0 W-C (TA/AT) -0,58ckcal/mol G0 W-C (GC/CG) -2,24 kcal/mol Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu GTAGACAATCTCCATCTCCTATCCTGATTAGAG ******************** GTTAGAGGTAGAGGATAGGA 5. Iontová síla - Koncentrace iontů, zejména MgII+ - Kationty kompenzují negativní náboj fosfátových skupin a usnadňují formování duplexu - Stabilita duplexu (Tm) je úměrná koncentraci iontů 6. Teplota - Se stoupající T je udržení duplexu energicky náročnější, po překročení určité T je preferována ssDNA – vyšší entropie celého systému Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu Není tedy nutná shodná Tm, ale shodná účinnost hybridizace obou primerů. Primery se stejnou Tm, ale rozdílnou G0, mohou vykazovat rozdílnou úspěšnost při tvorbě duplexu než primery s odpovídající G0. • Optimálně: primery jejichž 5’konce tvoří stabilní duplex, G0 <10 kcal/mol/37 C • Plynulý přechod G0 směrem k 3’konci až k cca -6kcal/mol. • Eliminace misprimingu (vzniklého hybridizací pouze 3’konce) • Vyloučení repetitivních oblastí, které mohou tvořit sekundární struktury • Komplementarita primerů – primer dimery • Specifita – hybridizace k jedinečnému místu v genomu (BLASTn) Vliv reakčního prostředí – i ideálně navržené primery mohou měnit své vlastnosti v závislosti na použitém PCR pufru a dalších parametrech PCR – vždy je nutná optimalizace jednotlivých PCR Design primerů • Různý design podle toho, zda je cílem kvantifikace DNA, mRNA nebo provedení alelické diskriminace nebo SNP • Použitá chemie • Detekce DNA, RNA nebo obou zároveň? Rozlišení HIV RNA od DNA začleněné do genomu • Kombinace fluoroforu a zhášeče • Modifikace sondy – LNA, PNA, MGB atd. • Multiplex assay Design sond Design hydrolyzačních sond • qPCR TaqMan - dvoukrokový proces – denaturace a annealing/extension • Co nejnižší Ct a nejvyšší ∆R (∆Rn) • Umístění 5’ konce sondy v rámci stanovované sekvence co nejblíže 3’ konci jednoho z primerů – účinné štěpení sondy • Optimální délka do 30 nukleotidů, obsah GC do 30% • AT bohaté sekvence – začlenění LNA, PNA nebo MGP • G – účinný quencher • Minimum repeticí, zejména GGGG, začlenění inosinu do repetice řeší tento problém • Tm proby od 10 C vyšší než Tm primerů F Q F F F Q Q Q Design hybridizačních sond (Lightcycler probes) • Sondy by měly být umístěny co nejdál od primeru 5’ – odečet fluorescence v annealingové fázi • GC 50% • Každá sonda má délku 23-35bp • Sondy o stejné Tm – musí se vázat současně ; Tm sond o 5-10 C vyšší než Tm primerů • 3’ konec akceptorové sondy fosforylován • Donor FAM, akceptor Cy5 nebo Lightcycler Red 640/705 • Vzdálenost mezi sondami 1-5 bazí (zajištění FRET) Design molekulárních majáků • Vazba majáku ideálně uprostřed amplikonu • Tm komplementárních ramen o 7-10 C vyšší než Tm primerů • Délka do 39 bp - omezení sekundárních struktur Design scorpion primers Sonda připojena k 5’ konci primeru a je komplementární k nově syntetizovanému řetězci • vlastní hybridizace sondy je intramolekulární událost • 17-27bp; Tm sondy