Analýza exprese a funkceAnalýza exprese a funkce microRNAmicroRNA AnalytickáAnalytická cytometriecytometrie 20.11.201220.11.2012 You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Analýza exprese a funkceAnalýza exprese a funkce microRNAmicroRNA 1.1. Regulační RNA molekulyRegulační RNA molekuly 2.2. StrukuraStrukura, vznik a funkce, vznik a funkce miRNAmiRNA 3.3. Databáze a predikceDatabáze a predikce miRNAmiRNA 4.4. Metody analýzyMetody analýzy miRNAmiRNA -- microarraysmicroarrays -- qPCRqPCR -- „„beadbead--basedbased methodsmethods““ -- funkční analýzyfunkční analýzy You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Opakování: transkripce, translaceOpakování: transkripce, translace http://www.nobelprize.org/educational/medicine/dna/ RT-PCR, microarray Western blotting You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Úrovně regulace genové expreseÚrovně regulace genové exprese Modifikace a remodelace chromatinu Transkripční faktory Sestřih RNA transkriptu Editace RNA transkriptu (připojení čepičky a polyA-konce)Stabilita mRNA Regulace translace (iniciační, elongační a terminační faktory) Posttranslační modifikace proteinů You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 1. Regulační RNA molekuly1. Regulační RNA molekuly  Negativní regulátory translace a stabilityNegativní regulátory translace a stability mRNAmRNA  1998 objev RNA interference1998 objev RNA interference (Andy(Andy FireFire aa CraigCraig MelloMello, Nobelova cena 2006), Nobelova cena 2006)  VýznamVýznam RNAiRNAi::  Inhibice translaceInhibice translace  UdrženíUdržení genomovégenomové stability (umlčenístability (umlčení transposonůtransposonů))  Obrana proti virové infekciObrana proti virové infekci  Udržení chromatinu v kondenzovanémUdržení chromatinu v kondenzovaném stavustavu -- zabránění transkripcezabránění transkripce  Experimentální umlčení genůExperimentální umlčení genů  Genová terapieGenová terapie You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Proč studovatProč studovat miRNAmiRNA  Evolučně konzervovaný mechanismusEvolučně konzervovaný mechanismus  Tkáňově specifická a časově ohraničená expreseTkáňově specifická a časově ohraničená exprese během embryogenezeběhem embryogeneze  Schopnost regulovat až třetinu genů vSchopnost regulovat až třetinu genů v organismu (kontrola buněčného cyklu,organismu (kontrola buněčného cyklu, apoptózyapoptózy,, vývojových a fyziologických procesů, buněčnéhovývojových a fyziologických procesů, buněčného cyklu,cyklu, apoptózyapoptózy, …), …)  Změny v expresi při mnoha onemocněníchZměny v expresi při mnoha onemocněních You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 1. Regulační RNA molekuly1. Regulační RNA molekuly  siRNAsiRNA –– short interfering RNA (dsRNA prekurzory s perfektníshort interfering RNA (dsRNA prekurzory s perfektní komplementaritou)komplementaritou)  miRNAmiRNA –– microRNA (dsRNA prekurzory s nedokonalým párováním)microRNA (dsRNA prekurzory s nedokonalým párováním)  piRNApiRNA –– PiwiPiwi--interactinginteracting (sekvence nejsou konzervované; umlčení(sekvence nejsou konzervované; umlčení retrotransposonůretrotransposonů v zárodečných buňkách)v zárodečných buňkách) Kim V. N. Genes Dev. 2006;20:1993-1997 You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 2.2. StrukuraStrukura miRNAmiRNA  miRNAmiRNA často kódovánačasto kódována intronyintrony genůgenů  Struktura vlásenkyStruktura vlásenky  „„SeedSeed region“region“ –– 88 nukleotidů s perfektnímnukleotidů s perfektním párovánímpárováním Lee RC, Feinbaum RL and Ambros V. 1993. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75: 843-85 You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 1. Dlouhý primární1. Dlouhý primární ttranskriptranskript -->> pripri--miRNAmiRNA (stovky(stovky ntnt-- desítkydesítky kbpkbp)) 2. Sestřih2. Sestřih -- RNasaRNasa IIIIII DroshaDrosha ++ PashaPasha/DGCR8/DGCR8 ––>> prepre--miRNAmiRNA (70(70 ntnt)) 3. Export (3. Export (ExportinExportin 5)5) 4. Maturace4. Maturace –– RnasaRnasa IIIIII DicerDicer –– začleněnízačlenění jednořetězcovéjednořetězcové 1919-- 2323 ntnt dlouhédlouhé miRNAmiRNA dodo komplexu RISCkomplexu RISC (tvořen(tvořen proteiny Argonaut)proteiny Argonaut) 5. Negativní regulace5. Negativní regulace mRNAmRNA –– inhibice translace neboinhibice translace nebo degradace (Pdegradace (P--bodiesbodies)) 2. Biogeneze2. Biogeneze miRNAmiRNA You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 2. Funkce2. Funkce miRNAmiRNA  VazbaVazba komplexu nakomplexu na 3´UTR3´UTR  DegradaceDegradace mRNAmRNA  InhibiceInhibice translacetranslace –– iniciační neboiniciační nebo elongačníelongační fázefáze http://www.nature.com/nrg/multimedia/rnai/animation/index.html You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Srovnání regulace pomocíSrovnání regulace pomocí miRNAmiRNA aa transkripčních faktorůtranskripčních faktorů Sayed, D., S. Rane, and M. Abdellatif, MicroRNAs Challenge the Status Quo of Therapeutic Targeting. Journal of Cardiovascular Translational Research, 2009. 2(1): p. 100-107. 1 Levels of miRNA are posttranscriptionally regulated. 2 This results in a miRNA attachment to the 3’UTR of a gene and inhibition of translation or mRNA degradation, or its detachment and activation of translation, thus, acting as a molecular switch that could result in an immediate early effect in response to an incoming signal. On the other hand, transcriptional regulation requires: 1 DNA remodeling; 2 atta chment or detachment of the transcription factor; and 3 inhibition or activation of RNA synthesis, before an effect on 4 protein levels is observed, thus, resulting in a relatively late response to an incoming signal You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 3. Databáze a predikce3. Databáze a predikce miRNAmiRNA  miRBasemiRBase (11/2011(11/2011 verver. 16.0). 16.0)  www.www.mirbasemirbase..orgorg Počet miRNA 18/11/2008: 8 619 záznamů (700 lidských) 4/11/2010: 15 172 záznamů (1114 lidských) 22/11/2011: 18226 záznamů (1587 lidských) 19/11/2012: (2237 lidských) You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 3. Predikce cílových molekul3. Predikce cílových molekul  Každá miRNA může regulovat až stovky různých molekulKaždá miRNA může regulovat až stovky různých molekul  miRNAmiRNA jsou krátkéjsou krátké  3´UTR jsou dlouhé a nepříliš kvalitně3´UTR jsou dlouhé a nepříliš kvalitně osekvenovanéosekvenované aa anotovanéanotované  Dosud málo ověřených cílových molekulDosud málo ověřených cílových molekul  Vazebná místa nejsou dokonale komplementárníVazebná místa nejsou dokonale komplementární  Klíčová oblastKlíčová oblast specifityspecifity je krátká (6je krátká (6--88 ntnt))  TargetScanTargetScan  PicTarPicTar  miRBasemiRBase TargetTarget You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 4. Metody analýzy4. Metody analýzy miRNAmiRNA  …… aneb co brát v úvahu při výběru metodyaneb co brát v úvahu při výběru metody  „„ThroughputThroughput““ –– počet vzorků,počet vzorků, miRNAmiRNA  Cena (reagencie, materiál, instrumentace)Cena (reagencie, materiál, instrumentace)  Otevřená vs. uzavřená platforma (možnostOtevřená vs. uzavřená platforma (možnost vytvářet vlastnívytvářet vlastní assaysassays))  Možnost standardizaceMožnost standardizace  Případné artefaktyPřípadné artefakty You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) 4. Metody analýzy exprese4. Metody analýzy exprese miRNAmiRNA a.a. Northern blotNorthern blot b.b. microarraysmicroarrays c.c. qPCRqPCR d.d. beadbead--basedbased methodsmethods •• funkční analýzyfunkční analýzy You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) a.a. NorthernNorthern blotblot  ČČasově náročná metoda pro malý počet vzorků aasově náročná metoda pro malý počet vzorků a miRNAmiRNA You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) b.b. ArraysArrays  Umožňují detekciUmožňují detekci velkého množstvívelkého množství miRNAmiRNA u maléhou malého počtu vzorkůpočtu vzorků  Rozlišení zralýchRozlišení zralých miRNAmiRNA aa prekurzorůprekurzorů  Výsledky nutnoVýsledky nutno validovatvalidovat dalšídalší metodoumetodou You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Zvýšení afinity You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) c.c. qRTqRT--PCRPCR –– SYBRSYBR GreenGreen  PoměrněPoměrně specifickáspecifická metodametoda  Slouží kSlouží k ověřeníověření výsledkůvýsledků získanýchzískaných pomocípomocí microarraymicroarray  SpecifickýSpecifický designdesign primerůprimerů You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) c.c. qRTqRT--PCRPCR -- TaqManTaqMan You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) d.d. BeadBead--basedbased methodsmethods (klinické(klinické aplikace)aplikace) You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Funkční analýzyFunkční analýzy  Slouží k ověření biologické funkceSlouží k ověření biologické funkce konkrétníkonkrétní miRNAmiRNA  Analýza cílové sekvence pomocíAnalýza cílové sekvence pomocí luciferázovéluciferázové aktivityaktivity  Zvýšení nebo snížení exprese konkrétníZvýšení nebo snížení exprese konkrétní miRNAmiRNA You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Funkční analýzyFunkční analýzy  LuciferázovéLuciferázové reportéryreportéry  OverOver--expreseexprese miRNAmiRNA ve forměve formě prekurzoruprekurzoru nebonebo zralézralé miRNAmiRNA  KnockdownKnockdown pomocípomocí modifikovanýchmodifikovaných próbprób -- inhibitorůinhibitorů You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) ShrnutíShrnutí  miRNAmiRNA mohou negativně regulovat až 30% genůmohou negativně regulovat až 30% genů interakcí s 3´UTR nainterakcí s 3´UTR na mRNAmRNA  Profil expreseProfil exprese miRNAmiRNA se mění při celé řaděse mění při celé řadě onemocněníonemocnění –– diagnostický či terapeutickýdiagnostický či terapeutický potenciálpotenciál  Metoda analýzy exprese závisí na počtuMetoda analýzy exprese závisí na počtu detekovanýchdetekovaných miRNAmiRNA a počtu vzorkůa počtu vzorků  Vybrané výsledky z „Vybrané výsledky z „highhigh--throughputthroughput“ metod je“ metod je vhodné ověřit jiným přístupemvhodné ověřit jiným přístupem You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Otázky? You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)