Bi9393 Analytická cytometrie Biofyzikální ústav AVČR Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. Lukáš Kubala, Ph.D. Pavla Gajdušková, Ph.D. Eva Bártová, Ph.D. Eva Slabáková, Ph.D. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. IBP-logo Struktura kurzu nPřednášky -8 lekcí o průtokové cytometrii a aplikacích -1 lekce o mikroskopii -3 lekce zaměřené na „microarrays“ nCvičení nSoučástí kurzu je praktické cvičení. Navíc bude jedna přednáška věnována praktické demonstraci. Vybraná zařízení budou demonstrována přímo v laboratořích BFÚ nTest nKurz bude zakončen zkouškou ve formě testu shrnujícího látku za celý semestr. Výsledek testu bude tvořit 75% celkového hodnocení. nSeminář nKaždý student bude prezentovat krátký seminář jehož téma bude konzultováno s přednášejícím a bude se týkat zaměření kurzu. Téma semináře bude shrnuto v krátkém textu ve stylu hesla pro CZ Wikipedii. Na základě této prezentace a odevzdaného textu bude udělen zápočet a hodnocení vlastního semináře se bude také z 25-ti % odrážet v celkové známce. Seminář studentů nTéma semináře musí vycházet z probírané technologie a musí být schváleno přednášejícím. nCílem je demonstrovat pochopení principů ze kterých vychází a jejich uplatnění v biologii. nPrezentace musí být připravena např. v PowerPoint(u). Prezentaci je nutné předložit v předstihu přednášejícímu ke konzultaci a posouzení. nDélka prezentace je 10 minut. nObsah prezentace shrnout v krátkém „Wiki“ textu. Seminář studentů – příklady témat nZákladní principy průtokové cytometrie nAnalýza dat z průtokového cytomeru nZákladní principy separace pomocí průtokové cytometrie nPrincipy fluorescence a fluorescenční značky nZáklady detekce fluorescence a zpracování signálu. nAplikace průtokové cytometrie –Imunofenotypová analýza krevních destiček. –Využití průtokové cytometrie v diagnostice alergických onemocnění. –Analýza DNA pomocí průtokové cytometrie. –Aplikace průtokové cytometrie při studiu imunologie bezobratlých. –Chromozómová analýza pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. –Extracelulární detekce cytokinů. –Monoklonální protilátky v průtokové cytometrii. –Imunofenotypová analýza periferních lymfocytů. –Využití průtokové cytometrie v cytogenetice. –Stanovení buněčné viability. –Metody detekce apoptózy. –Měření enzymatických aktivit pomocí průtokové cytometrie. –Zdroje excitace a optické systémy v průtokové cytometrii. –Detekce CD4+ T buněk u HIV pozitivních pacientů. –Aplikace FRET a FRAP. –Víceparametrové analýzy v průtokové cytometrii. –Průtoková cytometrie v diagnostice nádorových onemocnění. –Intracelulární detekce cytokinů. –Imunofenotypová analýza krevních destiček. –Využití průtokové cytometrie v diagnostice alergických onemocnění. n Informační zdroje – průtoková cytometrie nPractical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley-Liss; 4th edition nCytometry: New Developments, Volume 75, Fourth Edition (Methods in Cell Biology), Zbigniew Darzynkiewicz, Academic Press; 4th edition nPrůtoková cytometrie v klinické praxi, T. Eckschlager a kol., Grada 1999 nFlow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes; Jaroslav Dolezel (Editor), Johann Greilhuber (Editor), Jan Suda (Editor), February 2007 n Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na: http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/books/bookindx.htm 0471411256 cover_cytometry Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ. ecks_cover Informační zdroje – průtoková cytometrie (metody a protokoly) nThe Handbook of Flow Cytometry Methods nCurrent Protocols in Cytometry Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ. CPC robinson www.cyto.purdue.edu/.../slide0046_image018.jpg Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na: http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/books/bookindx.htm Informační zdroje – cytometrie (časopisy) nCytometry Part A nhttp://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/33945 n n n n nCytometry Part B: Clinical Cytometry nhttp://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/102019902 Jednotlivá čísla Cytometry Part A (od roku je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ. Cytometry Part A Cytometry Part B: Clinical Cytometry Informační zdroje – cytometrie (CD-ROM) Je možné zapůjčit po domluvě. covercd9 cdcover CD_cover CD_cover2 Informační zdroje – (Internet) nPurdue University, Cytometry Labs nhttp://www.cyto.purdue.edu/ nInternational Society for Analytical Cytology nhttp://www.isac-net.org/ nMolecular Probes (Invitrogen) nhttp://probes.invitrogen.com/handbook/ Informační zdroje - mikroskopie nTaatjes D. J. Cell Imaging Techniques, Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2005 nStephens D. Cell Imaging, Scion Publishing Ltd., 2006. nPawley, J. (Ed.), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed., 2006 Tyto knihy je možné zapůjčit ke studiu do knihovny BFÚ. 158829157X 1904842046 Informační zdroje - microarrays nMicroarray Analysis, Mark Schena, Wiley-Liss 2003 nGuide to Analysis of DNA Microarray Data, Second Edition, Steen Knudsen, Wiley-Liss 2004 nDNA microarrays: a molecular clonning manual. Bowtell D, Sambrook J., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2003. Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ. cover_arrays 0471656046 D5440 Obecný úvod do průtokové cytometrie nZákladní principy, možnosti průtokové cytometrie a její aplikace nHistorie Tyto částice mají něco společného … Algae Chromosomes Blood cells Protozoa … určité parametry těchto částic mohou být měřeny pomocí průtokové cytometrie. bd_logo cyflowsl Komerční zařízení Accuri C6 Flow Cytometer facsariaII_overview influx_image bd_lsr_cell_analyzer lsrii_product facscanto_overview facscalibur_overview image2 cell signaling CYAN 70729 Co můžeme analyzovat pomocí průtokové cytometrie? nPočítat částice v suspenzi nOddělit živé částice od neživých nHodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně než 1 minutu nKvantifikovat rozptyl světla, ale i intenzitu fluorescence nFyzicky separovat jednotlivé částice (populace) pro další analýzu Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Jaké jsou principy? nRozptyl světla (Light scatter) pomocí laseru nebo UV lampy nDetekce specifické flurescence nHydrodynamicky zaostřený proud částic nElektrostatická separace částic nMožnost multivariační analýzy dat Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Definice nPrůtoková cytometrie (flow cytometry) –Meření vlastností proudících částic (buněk) nPrůtokový sorting (flow sorting) –Separace částic (buněk) na základě parametrů měřených průtokovou cytometrií –také známo jako Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Technické součásti nZdroje světla nDetekční systémy nFluidní systém nSeparace nSběr dat nAnalýza dat J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Technické součásti nDetekční systémy Fotonásobiče (Photomultiplier Tubes (PMTs)) dříve 1-2 nyní 3-6 Diody detekce rozptylu světla (light scatters) nZdroje světla Lasery (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag UV (Arc) Lampy Mercury, Mercury-Xenon J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Cytometry Publications/Year Data taken from entrez_pubmed Stain Your Own Cell Life Technologies Logo Historie barvení biologických materiálů Až do poloviny 19. století – byly používány pouze přírodní barviva Anton van Leeuwenhoek použil v roce 1719 šafrán na obarvení svalových buněk www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html Historie barvení biologických materiálů Paul Ehrlich - 1879 použil kyselá a zásaditá barviva pro odlišení acidofilních,eosinofilních a neutrofilních leukocytů Clin Lab Med. 1993 Dec;13(4):759-71. The Ehrlich-Chenzinsky-Plehn-Malachowski-Romanowsky-Nocht-Jenner-May-Grunwald-Leishman-Reuter-Wright-Gi emsa-Lillie-Roe-Wilcox stain. The mystery unfolds. Woronzoff-Dashkoff KP. ix70biglightpaths Princip fluorescenčního Mikroskopu - August Köhler - 1904 http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/anatomy.html Historie barvení biologických materiálů Andrew Moldavan n Není jasné zda Moldavan vůbec svůj „počítač buněk“ sestrojil. Ve svém, článku popisuje mnoho problémů, ale žádné výsledky. Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells Andrew Moldavan Montreal, Canada Science 80:188-189, 1934 “The purpose of the experiment is to have each microscopical cell passing through the capillary tube, register itself automatically on the photoelectric apparatus, thus creating a micro-current which can be amplified and recorded.” J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Coons et al 1941 – vyvinuli techniku fluorescenčního značení protilátek - označili anti-pneumokokové protilátky pomocí antracénu. To jim umožnilo detekovat protilátky i patogeny v tkáni pomocí UV fluorescence. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group Albert H. Coons, Hugh J. Creech and R. Norman Jones Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, and the Chemical Laboratory, Harvard University Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 47:200-202, 1941 “Moreover, when Type II and III organisms were dried on different parts of the same slide, exposed to the conjugate for 30 minutes, washed in saline and distilled water, and mounted in glycerol, individual Type III organisms could be seen with the fluorescence microscope……” Coons a Kaplan (1950) - konjugovali fluorescein s isokyanátem (FITC) – získali lepší signál – dále od autofluorescence. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Friedman n Friedman (1950) – kombinoval kyselý fuchsin, akridinovou žlut´a berberin pro detekci buněk nádorů dělohy pomocí fluorescenčního microskopu 42685 Acid Fuchsin Acid magenta Acid rubin Acid roseine Absorption Max 540-545 von Bertalanffy & Bickis Ludwig von Bertalanffy (1901-1972) von Bertalanffy & Bickis (1956) - metachromatická fluorescence Akridinové oranže byla použita pro detekci RNA v tkáni - použili ji také pro rozlišení normálních a nádorových buněk 46005 Absorption Max 467 nm J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Gucker - 1947 nVyvinul průtokový cytometr pro detekci baktérií v aerosolu. nUtajená práce vynikala během Druhé světové války a byla publikována v roce 1947. nCílem byla rychlá detekce vzdušných spór a baktérii během válečného konfliktu. nInstrument: Proudí vzduch procházel skrz osvětlenou komůrku. Jako zdroj světla sloužila lampa ze světlometu a pro detekci byl použit fotonásobič. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 P.J. Crossland-Taylor „Sheath Flow“ princip “Provided there is no turbulence, the wide column of particles will then be accelerated to form a narrow column surrounded by fluid of the same refractive index which in turn is enclosed in a tube which will not interfere with observation of its axial content.” J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Wallace Coulter • nWallace Coulter - Coulter orifice - 1956 - n(patent 1953) – měření změny vodivosti během průchodu buněk v suspenzi malým otvorem Originální patentová aplikace W.Coultera 1953 Photo by J.Paul Robinson J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Jak počítat buňky? nHemocytometer (Bürkerova komůrka) byla standardem pro počítání buněk do ~ 1950 nRozměry jsou 3x3x0.1 mm. Obvykle jsou červené krvinky (1 x 106/mm3 )počítány po naředění 1:200 nLeukocyty (5x103/mm3) jsou ředěny 1:10 v roztoku lyzujícím červené krvinky nStatistická chyba: – koeficient variance (CV) je při 500 spočítaných buňkách 4.4% – chyba pipetování a ředění je ~ 10% Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Roche Innovatis Cedex Coulter Counter DSC03890 DSC03891 První komerční verze CC Untitled-7 Coulter Counter © CC Beckman Coulter nMultisizer™ 3&4 COULTER COUNTER® Roche Innovatis CASY TT DSC03898 Cytograph. Stolní přístroj schopný měřit rozptyl světla He-Ne laseru (1970). Mack Fulwyler- sorter n Mack Fulwyler - sorter 1965 - Los Alamos National Labs – jeho sorter separoval částice na základě elektronicky měřeného objemu (stejný princip jako Coulter counter) a separoval pomocí elektrostatického vychýlení. n Cílem bylo sortrovat červené krvinky,protože u nich byla naměřena bimodální distribuce buněčného objemu. Princip separace byl založen na principu inkoustové tiskárny Richarda Sweeta ze Stanfordu (1965) n Po té co bylo objasněno, že bimodalita červených krvinek je artefakt byla tato skupina schopna separovat neutrofily a lymfocyty z krve. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Untitled-6 Richard Sweet n Richard Sweet vyvinul elektrostatickou inkoustovou tiskárnu jejíž princip využil Mack Fulwyler pro svůj buněčný sorter. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 DSC03894 Mack Fulwyler- sorter DSC03895 Mack Fulwyler- sorter K. Souček Leonard Arthur "Len" Herzenberg Klíčové „cytometrické“ publikace n1934: Moldovan – Fotoelektrické meření buněk v kapiláře n1947: Gucker – fotoelektrické počítání buněk n1949: Coultrův počítač částic n1961: Rotman poprvé používá fluorescenci pro kvantifikaci enzymatické reakce n1964: Sweet – elektrostatická inkoustová tiskárna n1965: Fulwyler – květen 1965 - patent elektrostatického sorteru n1965: Kanetsky – spektrofotometrické měření buněk n1965: Fulwyler – listopad 1965 – publikace o buněčné separaci v časopise Science n1968: Gohde – první článek o fluorescenční průtokové cytometrii (v němčině) n1969: Gohde – patent n1969: Van Dilla – druhý článek o fluorescenční průtokové cytometrii n1969: Mullaney – první článek věnující se popisu rozptylu světla jako cytometrického parametru n1969: Heryenberg – třetí článek o fluorescenční průtokové cytometrii n1973: Gohde – patent dvojího značení n1977: Gohde – popis kompenzací signálu při dvojtém značení n1978: Kachel – flow imaging – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu n1983: izolace a detekce jader (DNA) z tkání zalitých v parafínu n1984: kongres o nomenklatuře cytometrie DNA n1987: Graz - vysokorychlostní sortrování chromozómů n1991: Robinson – automatizace klinických systémů – průtokový cytometr a čtečka čárkových kódů n n Zdroj – ISAC 2006 –The Wall of History flyier K čemu to všechno je… například… Zackary http://app2.iris.usm.maine.edu/gulfofmaine-censusdev/wp-content/images/Technology/FlowCytobotFigure 02.jpg K čemu to všechno je… například… n n n43 miliónů lidí na světě je infikováno virem HIV (WHO) nročně zemře ~ 2 miliónu lidí na HIV/AIDS (v Africe je ~ 11 miliónu AIDS sirotků) n kvantifikace CD4 T lymfocytů je klíčový parametr při monitorování léčby nPrůtoková cytometrie je „zlatý standard“ nOptimalizované postupy a zařízení pro levné (< 3 EUR / vzorek) a rychlé detekce (250 vzorků / den) n n CyFlow® miniPOC nhttp://www.cytometryforlife.org/ Co tomu předcházelo… nRozvoj techniky umožňující rychlou a reprodukovatelnou detekci cytometrických parametrů. nNové vědecké poznatky vedoucí k definici vhodných diagnostických markerů. [USEMAP] http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/start.htm?loc=http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/v ideo/video.html?v=Flowtheinvention.wmv ISAC presents: Mack Fulwyler - Innovator, Inventor & Pioneer [USEMAP] http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto10a/seminalcontributions/fulwyler.html Shrnutí přednášky nÚvod do kurzu nZdroje literatury nHistorie průtokové cytometrie nZákladní principy Na konci dnešní přednášky by jste měli: 1.vědět jaké jsou požadavky pro tento kurz 2.znát základní zdroje informací 3.mít stručný přehled o historii průtokové cytometrie 4.orientovat se v některých základních principech průtokové cytometrie