Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 2 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie new automatic cell cloning assay (ACCA) for determination of clonogenic capacity of CSCs single cell/well up to 384 well plate re-culture after sorting (2D, 3D) analysis: CyQuant, ATP, xCelligence, microscopy Principy průtokové cytometrie a sortrování nSvětlo nFluorescence nZdroje excitace, optické systémy a způsoby detekce fluorescence nFluidní systémy n K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Pojmy nFotometrie: nSvětlo – elektromagnetické záření viditelné lidským okem (400-750 nm, nejcitlivější ~ 550 nm). Při měření pod 400 nm (UV, IF) se v podstatě detekci záření (radiometrie). nEnergie záření se vyjadřuje v joulech nSvětelný tok (radiant flux) je udávána jako hodnota energie v čase ve wattech (1 watt= 1 joule/sekundu) nfoton – elementární částice. Popisuje je jejich vlnová délka, frekvence, energie a hybnost. Životnost fotonu je nekonečná (přesto vznikají a zanikají), existují pouze v pohybu. Má nulovou klidovou hmotnost, ale nenulovou energii, definovanou vztahem E = hν, kde h je Planckova konstanta a ν frekvence. Neboť má energii, působí na něj gravitace dle obecné teorie relativity a on sám gravitačně působí na okolí. (http://cs.wikipedia.org/wiki/Foton) nEnergie fotonu je vyjádřena jako E=hn a E=hc/l [n-frequency (Hz), c – rychlost světla (3x108 m/s), l-wavelength (nm), h-Planckova konstanta (6.63 x 10-34 J/s)] nEnergie je vyšší při kratších vlnových délkách a nižší při delších vlnových délkách. 488 x 10-3 Laser power nOne photon from a 488 nm argon laser has an energy of –E= 6.63x10-34 joule-seconds x 3x108 – – n nTo get 1 joule out of a 488 nm laser you need 2.45 x 1018 photons n1 watt (W) = 1 joule/second a 10 mW laser at 488 nm is putting out 2.45x1016 photons/sec – E=hn and E=hc/l = 4.08x10-19 J 3rd Ed. Shapiro p 77 original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy 325 x 10-3 What about a UV laser? E= 6.63x10-34 joule-seconds x 3x108 = 6.12 x 10-19 J so 1 Joule at 325 nm = 1.63x1018 photons What about a He-Ne laser? 633 x 10-3 E= 6.63x10-34 joule-seconds x 3x108 = 3.14 x 10-19 J so 1 Joule at 633 nm = 3.18x1018 photons 3rd Ed. Shapiro p 77 original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Polarization and Phase: Interference nElectric and magnetic fields are vectors - i.e. they have both magnitude and direction nThe inverse of the period (wavelength) is the frequency in Hz n 3rd Ed. Shapiro p 78 original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Interference Constructive Interference Destructive Interference A B C D A+B C+D 0o 90o 180o 270o 360o Wavelength Figure modified from Shapiro “Practical Flow Cytometry” Wiley-Liss, p79 Here we have a phase difference of 180o (2p radians) so the waves cancel each other out The frequency does not change, but the amplitude is doubled original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Rozptyl světla nHmota rozptyluje světlo vlnových délek které není schopna absorbovat nViditelné spektrum je 350-850 nm proto malé částice a molekuly (< 1/10 l) spíše viditelné světlo rozptylují nPro malé částice byl popsán tzv. Rayleightův rozptyl (scatter) jehož intenzita je ~ stejná všemi směry nRozptyl větších částic charakterizuje tzv. Mieův rozptyl. Jeho množství je větší ve směru v jakém dopadá světlo na ozářenou částici ð na tomto principu je založeno měření velikosti částic pomocí průtokového cytometru n n Shapiro p.106 mie http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html Rayleightův a Mieův rozptyl nRayleightův rozptyl – molekuly a velmi malé částice neabsorbují, ale rozptylují světlo které má menší vlnovou délku než je jejich velikost (modré nebe - vzduch rozptyluje lépe kratší vlnové délky) nMieův rozptyl je charakteristický pro částice větší než je vlnová délka světla (bílá záře kolem slunečního kotouče, mlžné světlo) DSC08172 DSC00158 kj kj http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Odraz a lom nSnellův zákon nPři šíření záření z prostředí opticky řidšího do opticky hustšího prostředí se paprsky lámou směrem ke kolmici. nPři šíření záření z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího prostředí se paprsky lámou směrem od kolmice. n Shapiro p 106 qt qi qr Incident Beam Reflected Beam Transmitted (refracted)Beam n1 sin Øi = n2 sin Øt Látka index lomu Vzduch (normální tlak) 1,0003 led 1,31 voda 1,33 etanol 1,36 sklo 1,5 až 1,9 sůl 1,52 safír 1,77 diamant 2,42 Brewster’s Angle Brewsters-angle brewster1a Photo ©2000 – J.P. Robinson http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Brewsters-angle.png Polarizační úhel – úhel dopadu při kterém částečně polarizované světlo prochází povrchem bez odrazu. Ohyb a rozklad světla Krátké vlnové délky jsou “ohnuty” více než dlouhé DSC07764 kj original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy © Microsoft Corp, 1995 Electromagnetic Spectrum Only a very small region within the ES is used for flow cytometry applications © J. P. Robinson, Purdue University George Gabriel Stokes (1819 – 1903) Anglický fyzik a matematik působící na univerzitě v Cambridge http://www.nndb.com/people/131/000097837/ 1852 – popsal fluorescenci Název vznikl z anglického slova fluospar (fluorit, kazivec = nerost CaF2) - ke svému pozorování použil roztok chininu, jako zdroj světla sluneční paprsky, jako excitační filtr sloužilo tmavě modré okenní sklo a jako emisní filtr byla použita sklenice bílého vína G. C. Stokes „On the Change of Refrangibility of Light“ Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 1852, vol. 142, p. 463.) fluorit4 Stokes K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Princip fluorescence Fluorescence je výsledek tří fázového u jevu některých chemickýc látek - fluorochromů, fluorescenčních barev. Fluorescenční značka (próba) -fluorochrom schopný lokalizace do určitého bilologockého vzorku nebo odpovídat na specifický podnět. Stage 1 : Excitation A photon of energy hvEX is supplied by an external source such as an incandescent lamp or a laser and absorbed by the fluorophore, creating an excited electronic singlet state (S1'). This process distinguishes fluorescence from chemiluminescence, in which the excited state is populated by a chemical reaction. Stage 2 : Excited-State Lifetime The excited state exists for a finite time (typically 1–10 10-9 seconds). During this time, the fluorophore undergoes conformational changes and is also subject to a multitude of possible interactions with its molecular environment. These processes have two important consequences. First, the energy of S1' is partially dissipated, yielding a relaxed singlet excited state (S1) from which fluorescence emission originates. Second, not all the molecules initially excited by absorption (Stage 1) return to the ground state (S0) by fluorescence emission. Other processes such as collisional quenching, fluorescence energy transfer and intersystem crossing (see below) may also depopulate S1. The fluorescence quantum yield, which is the ratio of the number of fluorescence photons emitted (Stage 3) to the number of photons absorbed (Stage 1), is a measure of the relative extent to which these processes occur. Stage 3 : Fluorescence Emission A photon of energy hvEM is emitted, returning the fluorophore to its ground state S0. Due to energy dissipation during the excited-state lifetime, the energy of this photon is lower, and therefore of longer wavelength, than the excitation photon hvEX. The difference in energy or wavelength represented by (hvEX–hvEM) is called the Stokes shift. The Stokes shift is fundamental to the sensitivity of fluorescence techniques because it allows emission photons to be detected against a low background, isolated from excitation photons. In contrast, absorption spectrophotometry requires measurement of transmitted light relative to high incident light levels at the same wavelength. Jablonski diagram illustrating the processes involved in the creation of an excited electronic singlet state by optical absorption and subsequent emission of fluorescence. The labeled stages 1, 2, 3 are referred to in the text. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční spektra Fluorescenční proces je cyklický. Kromě fluorochromu nevratně zničeného (photobleaching - „vysvícení“) může být opakovaně excitován. Excitation of a fluorophore at three different wavelengths (EX 1, EX 2, EX 3) does not change the emission profile but does produce variations in fluorescenceemission intensity (EM 1, EM 2, EM 3) that correspond to the amplitude of the excitation spectrum. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Detekce fluorescence Vybavení pro fluorescenci (1) zdroj excitace (2) fluorochrom (3) vlnové filtry pro izolaci emitovaných fotonů od excitovaných (4) detektory pro registraci emitovaných fotonů Fluorescenční přístroje - spektrofluorometer měří průměrné vlastnosti objemu vzorku v kyvetě. - fluorescenční mikroskop popisuje fluorescenci jako jev v prostorovém systému souřadnic - flow cytometer měří fluorescenci v proudícím toku, umožňuje detekovat a kvantivikovat subpopulace uvnitř velkého vzorku Fluorescenční signál - spektrofluorometer je flexibilní, umožňuje měřit v kontinuálním spektru excitačních a emisních vlnových délek - flow cytometr potřebuje fluorescenční značky excitovatelné určitou vlnovou délkou. Fluorescence pozadí - endogení složky - autofluorescence - nenávazané nebo nespecificky vázané značky = reagenční pozadí Vícebarevné značení - dvě a více značek, zároveň monitoruje různé funkce - nutné: vhodně zvolit značky zdroj excitace a separační filtry K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescence Output of Fluorophores Comparing Different Dyes F-actin ~ BODIPY FL phallacidin anti-ß tubulin ~ Texas Red goat anti–mouse IgG DNA ~ DAPI Mouse 3T3 l Hind III propidium iodide K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie [USEMAP] Table of Fluorochromes http://pingu.salk.edu/fcm/fluo.html K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Create Your Virtual Cell nhttp://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Cell-Staining-Tool.html DSC08701 Procesy interferující a detekcí fluorescence nQuenching - „zhášení“ fluorescence pomocí polárních rozpouštědel, těžkých iontů. nBleaching – změna struktury fluorescenční molekuly vedoucí ke ztrátě fluorescence (působením světla a nebo chemickou interakcí. nPhoton saturation – stav kdy množství molekul v excitovaném stavu odpovídá množství molekul v bazální hladině K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Photobleaching - irreversible destruction or photobleaching of the excited fluorophore Oregon Green 514 goat anti–mouse IgG fluorescein goat anti–mouse IgG anti–human cytochrome oxidase subunit I K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Základ průtokové cytometrie Buňky v suspenzi protékají jednotlivě napříč osvětlenou částí kde rozptylují světlo a emitují fluorescenci, která je detekována, filtrována a převedena na digitální hodnoty uložené do počítače Fluidics Optics Electronics original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - zdroj světla •nutnost zaostřit zdroj světla na stejné místo, kde je zaostřen průtok buněk •Lasery •produkují jednotlivou vlnovou délku světla (325, 488, ~630nm) •poskytují mW - W světla •mohou být “levné” - air-cooled , nebo drahé - water-cooled •poskytují koherentní světelný proud •Obloukové lampy (Arc-lamps) •produkují směs vlnových délek, které musí být filtrovány •poskytují mW světla •levné - air-cooled •nekoherentní světelný proud - optické kanály •cesta světla z místa ozáření buněk k detektoru •optické části separují určité vlnové délky original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy LASER(y) lase - koherentní (souvislý světelný tok) - monochromatický - soustředěný - http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/hframe.html http://www.ilt.fraunhofer.de/eng/100053.html http://en.wikipedia.org/wiki/Helium-neon_laser K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie [USEMAP] LASER vs. Arc lamp http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Helium_neon_laser_spectrum.png DSC04470 H.M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 4th ed. http://en.wikipedia.org/wiki/Helium-neon_laser http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/sources.html K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Optika - „Forward Scatter“ kanál •část světla rozptýlená ve stejné ose jako je směr světelného paprsku •intenzita „forward scatteru“ odpovídá velikosti, tvaru a optické homogenitě buněk original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Forward Angle Light Scatter FALS Sensor Laser original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - „Side Scatter“ kanál •část světla rozptýlená kolmo do strany od osy směru světelného paprsku side (90o) scatter channel •intenzita „side scatteru“ odpovídá velikosti, tvaru a optické homogenitě buněk original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy 90 Degree Light Scatter FALS Sensor 90LS Sensor Laser original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - Light Scatter •„Forward scatter“ zachycuje povrchové vlastnosti a velikost částic •může být použit k rozlišení živých a mrtvých buněk •„Side scatter“ odpovídá inkluzím uvnitř buněk •možno odlišit granulární a negranulární populaci original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - fluorescenční kanály •fluorescence emitovaná z každého fluorochromu je detekována pomocí specifického fluorescenčního kanálu •specifita detekce je kontrolována vlnovou selektivitou filtru a zrcadel original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Laser Fluorescence Detectors Fluorescence FALS Sensor Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - vlastnosti filtrů •jsou konstruovány z materiálů absorbujících určitou vlnovou délku (a propouštějí jinou) •přechod mezi absorbancí a transmisí není přesný; nutné specifikovat lom světla při konstrukci filtru original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Chroma Technology Corporation Optics - vlastnosti filtrů •„Long pass“ filtr propouští vlnovou délku nad „řezanou“ délkou •„Short pass“ filtr propouští vlnovou délku pod „řezanou“ délkou •„Band pass“ filtr propouští vlnovou délku v úzkém rozmezí okolo specifické vlnové délky original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Standard Long Pass Filters Transmitted Light Light Source 520 nm Long Pass Filter >520 nm Light Transmitted Light Light Source 575 nm Short Pass Filter <575 nm Light Standard Short Pass Filters original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Standard Band Pass Filters Transmitted Light White Light Source 630 nm BandPass Filter 620 -640 nm Light original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - vlastnosti filtrů •pokud je filtr umístěn v 45o úhlu ke zdroji světla, světlo, které má projít tak projde, ale blokované světlo je odraženo v 90o úhlu •dichroické filtry, dichroická zrcadla original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Dichroic Filter/Mirror Filter placed at 45o Reflected light Transmitted Light Light Source original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - uspořádání filtrů •k společnému měření více než jednoho „scatteru“ nebo fluorescence , používáme mnohonásobné kanály (a detektory) •multikanálové uspořádání musí splňovat •spektrální vlastnosti použitého fluorochromu •správný řád uspořádání filtrů a zrcadel original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Optika - detektory •dva obecné typy detektorů •fotodioda •používá se pro silný signál (forward scatter detector) •fotonásobič (photomultiplier tube - PMT) •citlivější než fotodioda, muže být poškozen přesvícením original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy Schematic of a photomultiplier tube coupled to a scintillator. Photomultiplier tubes (photomultipliers, PMTs) http://en.wikipedia.org/wiki/Photomultiplier Základní charakteristika: -vysoce citlivé detektory (jeden foton) -velké zesílení signálu/nízký šum -velká plocha detekce -rychlá frekvence odpovědi -velké pracovní napětí (1000 – 2000 V) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fotodioda Porovnání s PMT Výhody: 1. excelentní linearita signálu 2. rozsah spektrální detekce 190 nm to 1100 nm (silicon) 3. nízký šum 4. Odolnost vůči mechanickým vlivům 5. nízká cena 6. malá velikost a hmotnost 7. dlouhá životnost 8. Vysoká kvantová účinnost (~80%) 9. Nepotřebuje vysoká napětí Nevýhody 1. Malá plocha 2. Nemožnost integrálního zesílení 3. Mnohem nižní citlivost 4. Počítání fotonů pouze u speciálních produktů 5. Kratší čas odpovědi http://en.wikipedia.org/wiki/Photodiode K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie PMT PMT PMT PMT Dichroic Filters Bandpass Filters Example Channel Layout for Laser-based Flow Cytometry Laser 1 2 3 4 Flow cell original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy pmt_large DETECTOR BD FACSCalibur system facs_calibur_opt calibur [USEMAP] http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/ K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie BD LSR II system LSRbig DETECTOR LSRoptics [USEMAP] http://jcsmr.anu.edu.au/facslab/facs/LSR2.html BD FACSVerse system https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRNv0PjbLwo7NdaR6aMn3CBj6Hrs7prefIApP2UjTIlfrV 8NNQp [USEMAP] http://www.bdbiosciences.com/instruments/facsverse/features/index.jsp Aria II Ethidium PE cis-Parinaric acid Texas Red PE-TR Conj. PI FITC 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 Common Laser Lines Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Octagon Detection System SSC PE PE-Cy7 FITC PerCP-Cy5.5 PE-TxRed bd_logo “kostka” pro konvenční fluorescenční mikroskop Acousto Optical Beam Splitter AOBS® Acousto Optical Beam Splitter AOBS® [USEMAP] [USEMAP] http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/filters/aotf/index.html http://simple.wikipedia.org/wiki/Tellurium Supercontinuum Generation -a nonlinear process for strong spectral broadening of light The benefits of AOBS® •Adaptable to any new dye •8 lines simultaneously •Reflected light imaging •High transmission •Truly confocal – real optical sectioning •Fast switching •Freely tunable •Fluorescence correlation spectroscopy with multi-line lasers [USEMAP] http://www.bdbiosciences.com/spectra/ bd_logo Fluorescence Spectrum Viewer K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluidics Cart Cytometer Fluidní systém: BD FACSAria II AIR PRESSURE BULK INJECTION Sheath Tank AIR PRESSURE ASPIRATED WASTE (VACUUM) ASPIRATED WASTE (DEGAS) SHEATH FILTER 0” – 9” R1 Sheath Regulator R2 Sample Regulator V17 V20 V5 V6 Hydrodynamic focussing in the cuvette Sheath Sample Sheath Sample Sample pressure low, small core stream. Good for DNA analysis High sample pressure, broader core stream. Bad for DNA analysis Laser Beams ANd9GcSG6MDDEyKW2lrEy-4pYcbhalq94g7mws3iCujkWC8szVoIZvRtvw • tlak nosné (oplašťující) kapaliny vede pufr kyvetou a vyšší tlak ve zkumavce se vzorkem zavádí vzorek do kyvety. • • Princip hydrodynamického zaostření zarovná buňky v kyvetě „jako perly na šňůrce“ předtím než dojdou do bodu kde protnout paprsek laseru. • •Hydrodynamické zaostření nemůže oddělit buněčné agregáty. Průtoková cytometrie vyžaduje suspenzi jednotlivých buněk! Fluidika – shrnutí 2 Shrnutí přednášky nSvětlo nFluorescence nZdroje světla a optické systémy průtokového cytometru nFluidní systémy n Na konci dnešní přednášky by jste měli: 1.znát základní principy rozptylu světla a 2.fluorescence; 3.vědět jaké zdroje světla se využívají v průtokové cytometrii; 4.a jakým způsobem je detekováno; 5.znát základní principy fluidních systémů a laminárního proudění. 6. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie