Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 5 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční proteiny nbioluminescence resonance energy transfer (BRET) –Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. –je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. –modré světlo excituje green fluorescent protein. –Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. –luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. –modré světlo excituje green fluorescent protein. – – Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm n n O2• – O2 H2O2 • OH H2O 4 e– reduction to water e– e– e– e– Not so terribly reactive with most biomolecules Maintained at very low concentration Catalases, peroxidases, GSH, etc… Actually a chemical reductant Not so terribly reactive with most biomolecules Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen Maintained at very low concentration Superoxide dismutases Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates The molecule that makes ionizing radiation toxic Unreactive at STP, but a great electron acceptor Biological activation via radicals, transition metals Generally, radical intermediates are enzyme-bound © Simon Melov DCFH-DA DCFH DCF COOH H Cl O O-C-CH3 O CH3-C-O Cl O COOH H Cl OH HO Cl O COOH H Cl O HO Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation 2’,7’-dichlorofluorescin 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate 2’,7’-dichlorofluorescein Cellular Esterases H2O2 DCFH-DA DCFH-DA DCFH DCF H O 2 2 Lymphocytes Monocytes Neutrophils log FITC Fluorescence .1 1000 100 10 1 0 20 40 60 PMA-stimulated PMN Control 80 © J. P. Robinson, Purdue University Fluorescent sensors for detection of H2O2 Variants & fusions npHyPer-cyto vector npHyPer-dMito vector –Duplicated mitochondrial targeting sequence (MTS) is fused to the HyPer N-terminus. MTS was derived from the subunit VIII of human cytochrome C oxidase [Rizzuto et al., 1989; Rizzuto et al., 1995]. npHyPer-nuc vector –Three copies of the nuclear localization signal (NLS) fused to the HyPer C-terminus provide for efficient translocation of HyPer to the nuclei of mammalian cells [Fischer-Fantuzzi and Vesco, 1988] n n n „High Throughput Flow Cytometry“ nautomatizace + robotizace = urychlení a efektivita sběru dat (měření desítky vzorků za hodinu s minimálním zásahem operátora ) nvyužití principu vícebarevné analýzy K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Automatizované systémy měření vzorků Automatický karusel (autosampler) Adaptér pro nasávání vzorků z mikrotitrační desky logo_becton%20dickinson Automatizovaný „microsampler“ systém cytek K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Universal Loader - Lab Image https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSG6MDDEyKW2lrEy-4pYcbhalq94g7mws3iCujkWC8szVo IZvRtvw The steps in a high-throughput fluorescence-microscopy experiment. Analysis [USEMAP] http://www.stanford.edu/group/nolan/ Garry Nolan Peter Krutzik „Fluorescent cell barcoding“ Fig 1 full size Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie > Fig 3 full size Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Cytometric bead array (CBA) nMultiplexed Bead-Based Immunoassays nflow cytometry application that allows users to quantify multiple proteins simultaneously Multiplex microsphere‐based flow cytometric platforms for protein analysis and their application in clinical proteomics – from assays to results ELECTROPHORESIS Volume 30, Issue 23, pages 4008-4019, 3 DEC 2009 DOI: 10.1002/elps.200900211 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.200900211/full#fig1 Microspheres can be immobilized with capture molecules and immunoassays can be performed. (A) Coupling reactions for microspheres: Microspheres with functional groups (carboxyl‐, thiol‐) can be used for immobilizing peptides, proteins, or amino group‐functionalized molecules; alternatively, streptavidin‐functionalized microspheres can be applied for biotin‐labeled capture molecules. (B) Standard capture sandwich assay: An individual assay involving an optically encoded microsphere immobilized with a specific capture molecule (antibody) is being carried out on the particle. After sample incubation, another analyte‐specific antibody (a so‐called detection antibody, which is biotinylated and usually recognizes epitopes that are different from that of the capture antibodies) is then applied to the reaction. The presence and quantity of the reporter tag (e.g. strepavidin‐phycoerythrin) allows the precise quantification of the reactions that occur. © This slide is made available for non-commercial use only. Please note that permission may be required for re-use of images in which the copyright is owned by a third party. CBA CBA nmultiplexing capabilities nspeed nincorporation of multiple assay formats nrapid assay development and reasonable cost nautomation Biologické aplikace průtokové cytometrie nCytogenetika –analýza chromozómů •karyotyp •sortrování –chromozómové DNA knihovny –FISH značení (chromosome painting) • K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Analýza a sortrování chromozómů Analýza a sortrování chromozómů nsynchronizace buněk – zisk metafázních chromozómů (colcemid, hydroxyurea) nizolace chromozómů nznačení DAPI nebo Hoechst vs. chromomycin A3 (CA3) nebo mithramycin n= celková DNA vs. G/C-bohaté oblasti n NCBI PubChem logo http://www.scienceclarified.com/Ca-Ch/Chromosome.html http://www.nccr-oncology.ch/scripts/page9243.html Analýza a sortrování chromozómů e-bang „Flow karyotype“ http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/ ♂ ♀ Karcinom močového měchýře Sortrování chromozómů Pisum sativum Sortrování chromozómů Vicia faba Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nekologie npotravinářství nbioterorismus http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/ Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nviabilita nmetabolické funkce nsortrování nanalýza aerosolů (Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps)) n Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nSortrování –EPICS + Autoclone® modul n Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps) http://www.dres.dnd.ca/ResearchTech/Products/CB_PRODUCTS/RD98001/index_e.html Průtoková cytometrie kvasinek nbuněčné dělení nviabilita nmembránový potenciál nrespirace nprodukce H2O2 ncitlivost k antibiotikům nseparace n Saccharomyces cerevisiae http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Budding_yeast_Lifecycle.png http://www.sbs.utexas.edu/mycology/sza_images_SEM.htm Průtoková cytometrie kvasinek Průtoková cytometrie v hydrobiologii nstudium pico- a nano-fytoplanktonu (< 20 mM) nanalýza metabolických funkcí planktonu nstudium pigmentace (analýza chlorofylu a fykoeritrinu) Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie v hydrobiologii nanalýza DNA http://planktonnet.awi.de/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&asset_id=15127 http://www.soes.soton.ac.uk/staff/tt/ [USEMAP] Průtoková cytometrie v hydrobiologii http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/sieracki/sierack2.htm Absorption Spectrum Emission Spectrum http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/chlorophyll-a(MeOH).html Průtoková cytometrie bezobratlých nlze aplikovat běžné metodické přístupy a fluorescenční značky n nPříklady aplikací: –buněčný cyklus –cytotoxicita –apoptóza Long Tongue Tachinid Fly 240px-Miesmuscheln_Mytilus_2 Invertebrate Survival Journal [USEMAP] http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/insects/index.html ex vivo flow cytometrie - limitace nOvlivnění některých vlastností buněk (morfologie, exprese znaků); nneumožnuje dlouhodobější studie buněčného metabolismu a buněčných interakcí (komunikace, adheze) v přirozeném tkáňovém mikroprostředí; ndalší: –nízká citlivost pro detekci vzácných buněčných subpopulací (1-10 buněk/ml ~ 5000 – 50000 buněk v 5 litrech krve dospělého člověka); –časově náročná příprava vzorku (hodiny, dny); –diskontinuita odebíraných vzorků. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo vizualizace - limitace nTloušťka tkáně Christ with St. Joseph in the Carpenter's Shop Georges De La Tour, ~ 1640 (Musee du Louvre, Paris). http://www.photobiology.info/PhotobioInArt_files/Candle3.png Průchod světla tkání http://www.photobiology.info/PhotobioInArt_files/hand1.png The absorption spectrum of a human hand. The spectrum was recorded with a very sensitive spectrophotometer with the hand in close juxtaposition with the photocathode (unpublished data of Karl H. Norris, from The Science of Photobiology (KC Smith, ed., Plenum Press, 1977; p. 400). Effective penetration depth in breast tissue in vivo flow cytometry – základní principy nZobrazení buněk přímo v krevním nebo lymfatickém řečišti. nVizualizace pomocí CCD nebo CMOS kamery po ozáření konvenční mikroskopickou lampou nebo lasery. nDetekce absorbce, fluorescence, Ramanova spektra, fototermálních nebo fotoakustických signálů. n Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – bez značení nNahrávka videa pomocí vysokorychlostní CCD nebo CMOS kamery s vysokým rozlišením v režimu propustnosti nebo odrazu. nPříklad: high-speed transmittance digital microscopy (TDM) nLimity: hloubka tkáně. nTDM může sloužit k navedení zdrojů záření pro další analýzu do určené oblasti. n n Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 photoacoustic and photothermal imaging nThe photoacoustic effect was first discovered by Alexander Graham Bell in his search for a means of wireless communication.1 Bell succeeded in transmitting sound with an invention he called the “photophone,” which carried a vocal signal with a beam of sunlight that was reflected by a vocally modulated mirror. The sound could be recovered with an ordinary telephone receiver connected to a selenium cell illuminated by the light. Bell published the results in a presentation to the American Association for the Advancement of Science in 1880. The Photoacoustic Effect Benjamin T. Spike Physics 325 April 21, 2006 Schematic illustration of photoacoustic imaging Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 ACS Nano 2010 4 (8), 4559-4564 In vivo flow cytometrie – detekce specifických signálů nDetekce fotoakustických a fototermálních jevů Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry - aplikace Shrnutí přednášky n„High-throughput“ průtoková cytometrie … n … a uplatnění vícebarevné detekce a beads array n sortrování chromozómů n aplikace v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých nin vivo průtoková cytometrie Na konci dnešní přednášky by jste měli: 1. 1.vědět co je to „high-throughput„ průtoká cytometrie …a jak se v ní může uplatnit princip vícebarevného značení. 2.znát základní principy měření a sortrování chromozómů pomocí průtokového cytometru; 3.mít představu o možných aplikacích průtokové cytometrie v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých; 4.rozumět limitům a principům in vivo průtokové cytometrie. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie