1
Principy microarrays
Pavla Gajdušková
Analytická cytometrie, 13. listopadu 2012
Microarrays
Kolekce DNA sond přichycených k pevnému podkladu
Fotolitografie„Tištěná“ microarrays
Microarray technologie
I. Výběr sond (probes): cDNA vektory, BAC vektory,
krátké nebo dlouhé oligonukleotidy, proteiny, tkáně
II. Příprava microarray: nanesení sond na sklo nebo
membránu
III. Design experimentu: zvolení správné metody, použití
referečního vzorku, záměna fluorescenčních barev
IV. Fluorescenční značení vzorků
V. Analýza microarray obrazů: nalezení sond v obraze,
korekce pozadí, výpočet intenzity v jednotlivých
bodech
IV. Analýza dat: filtrování, normalizace, porovnání
výsledků získaných z více microarray experimentů –
klastrovací analýza
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
2
Technologie přípravy microarrays
I. tisk pomocí skleněných kapilár (na podložní skla)
(výzkumné laboratoře)
III. fotolitografie (Affymetrix, NymbleGen)
II. ink-jet tisk (Agilent)
IV. samosestavování silikonových kuliček (Illumina)
Microarrays tištěná pomocí skleněných kapilár
Zdroj DNA pro tisk pomocí kapilár
I. dlouhé oligonukleotidy:
~ 60 - 70mers
komerčně dostupné (Operon, Agilent)
II. cDNA:
knihovny cDNA vektorů (IMAGE, MGC)
dostatečné množství DNA se vyprodukuje pomocí PCR
(univerzální primery pro daný typ vektorů)
III. BAC (Bacterial Artificial Clones): malý výtěžek při izolaci,
vysokomolekulární (lepivá) DNA, nutná následná
amplifikace DNA spojená s rozdělením na menší úseky
(DOP-PCR, ligation-mediated PCR)
Microarrays tištěná pomocí skleněných kapilár
3
Úprava povrchu sklíček pro tisk arrays I
povrchová úprava skla: amino modifikace, poly-L-lysine
modifikace povrchu → natisknutí DNA sond → UV ozáření
From Lee N. H. presentation: Introduction to High Density Microarrays
Sklo
Úprava povrchu sklíček pro tisk arrays II
DNASklo
From Lee N. H. presentation: Introduction to High Density Microarrays
povrchová úprava skla: epoxidová modifikace
úprava DNA: amino-modifikace DNA
“ink-jet” tisk
Oligonukleotidy dlouhé 60 b
pravidelnější tvar sond
a jejich rozmístění
firma: Agilent
Fotolitografický způsob přípravy
„In-situ“ syntéza
syntéza oligonukleotidů přímo na membráně
4
Fotolitografický způsob přípravy (Affymetrix)
sondy = oligonukleotidy délky 25 bazí
sondy = oligonucleotidy 45-85 bazí
podobná teplota tání (Tm)
Fotolitografický způsob přípravy (NimbleGen)
Samosestavování silikonových kuliček
základní stavební jednotka: silikonová kulička (3uM), která je pokryta
mnoha kopiemi stejných specifických oligonukleotidů
kulička nemá přesně dané místo na sklíčku, po fixaci na sklíčku je její
typ identifikován díky sekvenci části oligonukleotidu
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
5
exprese proteinů (ELISA)proteinprotilátkyProtein
všechno dříve zmíněné,
sekvenování, anotace genů
všechno dříve zmíněnéDNATilling
místa vazby transkripčních
faktorů, modifikace histonů
DNA (ChiP
obohacená)
DNA (promotorové
oblasti ~ 1kb)
Promoter
míra metylace promotorových
oblastí
DNA (ovlivněná
bisulfidem sodným)
DNA (CpG islands)Metylace
detekce „Single Nucleotid
Polymorphysms“; změny v
genomu
DNADNA
(oligonukleotidy)
SNP
změny v genomu (zisk, ztráta
chromozomů nebo jejich částí
DNADNA (BAC vektory,
oligonukleotidy)
CGH
měření množství miRNAmiRNAoligonukleotidymiRNA
měření množství mRNA v
bunkách, nádorech ...
cDNA / mRNADNA (cDNA,
oligonucleotidy)
Expresní
... analýza čeho
Co se
fluorescenčně
značí a hybridizuje
Sondy
na microarray
Typ array
Oblasti použití microarrays v biologii Oblasti použití microarrays v biologii
DNA RNA protein
transkripce translace
Oblasti použití microarrays v biologii
DNA RNA protein
Schena M., Shalon D., Davis R. W., Brown P. O.
Quantitative monitoring of gene expression patterns with a
complementary DNA microarray. Science 270: 467-70, 1995.
transkripce translace
Genová exprese
Exon1 Exon2 Exon3 Exon4 Exon5 Exon6
mRNA
Intron1 Intron2 Intron3 Intron4 Intron5
DNA
5’ 3’
transkripce
translace
protein
ATG STOP
untranslated regions
6
Genová exprese
Exon1 Exon2 Exon3 Exon4 Exon5 Exon6
mRNA
Intron1 Intron2 Intron3 Intron4 Intron5
DNA
5’ 3’
transkripce
cDNA
zpětná
transkripce
(RT)
cDNA: jednořetězcová DNA (v dalším kroku je možné syntetizovat druhý řetězec)
u genů s dlouhou mRNA nemusí vznikat vždy celá cDNA
5’3’
Metody měření množství mRNA
From Lee N. H. presentation: Introduction to High Density Microarrays
•RT-PCR and Real-time RT-PCR
Měření množství mRNA
(microarrays tištěné pomocí skleněných kapilár) I. dlouhé oligonukleotidy:
~ 60 - 70mers
komerčně dostupné (Operon, Agilent)
II. cDNA:
knihovny cDNA vektorů (IMAGE, MGC)
dostatečné množství DNA se vyprodukuje pomocí PCR
(univerzální primery pro daný typ vektorů)
5’ 3’
mRNA
dlouhé oligonukleotidy
c DNA
Typ sond
7
Experimentální design
Příklady použití v molekulární biologii (na úrovni mRNA):
• aplikace chemické látky na buněčnou kulturu a její vliv na expresi
různých genů (najít geny, které sníží nebo naopak zvýší expresi mRNA)
• zvýšení exprese mRNA zvoleného genu vnesením plasmidu →
nalezení dalších genů se změněnou expresí
• snížení exprese mRNA zvoleného genu po vnesení specifické siRNA →
nalezení dalších genů se změněnou expresí
Experimentální design
Porovnání exprese mezi vzorky:
Loop design: každé dva vzorky
jsou hybridizovány na jedno sklo
(plus vzájemná záměna
fluorochromů)
Reference design: každý vzorek
je hybridizován s referenčním
vzorkem, který pak slouží jako
převodník mezi různými vzorky
A E
C
AB
DB
ECA DB
R
???
E
CA
D
B
E
CA
D
B1.
2.
Loop design
poskytuje přímé srovnání mezi vzorky
o každém vzorku získáme více informací - kontrola
vyžaduje větší množství RNA z každého vzorku
špatný vzorek více ovlivní celý experiment
Reference design
lze jednoduše rozšířit o nový vzorek
jednodušší interpretace výsledků
vyžaduje méně RNA ze vzorků
špatný vzorek méně ovlivní celý experiment
Experimentální design Fluoresceční značení
Značení:
Přímé: jeden z nukleotidů je značen fluorescenční značkou
nukleotid s fluorescenční barvou zaujímá více místa
značen každý 30-35 nukleotid nižší intenzita fluorescence
než nepřímé značení
Nepřímé: jeden z nukleotidů modifikován reaktivní amino
skupinou, na kterou se potom váže fluorochrom (NHS
ester forma)
pracnější v laboratoři než přímé značení
8
Měření množství mRNA
(fotolitograficky připravené microarrays)
Typ sond
oligonukleotidy 25 bazí
Perfect Match vs MisMatch oligonukleotidy
PM MM
cDNA
Dříve:
sondy blíže k 3’ konci mRNA
11-16 na jeden gen
PM, MM sondy
Typ sond
oligonukleotidy 25 bazí
Nyní:
sondy v různých exonech genu (ideálně 4 sondy v každém exonu)
jenom PM sondy
umožňuje studovat alternativní sestřih
Experimentální design
Příklady použití v molekulární biologii (na úrovni mRNA):
• aplikace chemické látky na buněčnou kulturu a její vliv na expresi
různých genů (najít geny, které sníží nebo naopak zvýší expresi mRNA)
• zvýšení exprese mRNA zvoleného genu vnesením plasmidu →
nalezení dalších genů se změněnou expresí
• snížení exprese mRNA zvoleného genu po vnesení specifické siRNA →
nalezení dalších genů se změněnou expresí
9
Nepřímé: jeden z nukleotidů modifikován biotinem, který se detekuje
pomocí fluorescenčně značené protilátky až po hybridizaci
biotinem se značí cRNA (in vitro transcription)
mRNA first strand cDNA double strand cDNA cRNA
Fluoresceční značení Porovnání tištěných a fotolitograficky
připravených microarrays
nepřímé srovnáníumožňuje přímé srovnánídesign
experimentu
dříve nemožná,
dnes možná
jednoducháúprava podle
požadavků
možné studovatnelze studovat
(neplatí pro dlouhé oligo)
alternativní
sestřih
menší variabilita mezi
sklíčky
větší variabilita mezi
sklíčky
tisk
jednoduššínáročná
práce s knihovnami
(neplatí pro dlouhé oligo)
příprava
až 6 500 000až 33 000počet sond
fotolitografietisk kapilárami
Měření množství mRNA
(Allumina samosestavovací arrays)
Samosestavování silikonových kuliček
základní stavební jednotka: silikonová kulička (3uM)
kulička nemá přesně dané místo na sklíčku, po fixaci na sklíčku je její
typ identifikován díky sekvenci části oligonukleotidu
oligonukleotid:
I. adresa (definuje typ kuličky)
II. vlastní sonda - oligonucleotid (50 bp), který je specifický
pro jednotlivé transkripty
míra exprese mRNA = intenzita fluorescence navázané cRNA
10
Objevování nových transkriptů
objevování nových transkriptů, které nejsou ještě ve veřejných
databázích (např. SeqRef, Emsembl)
nebylo to možné pomocí výše zmíněných technologií, protože ty
jsou založené na znalostech obsažených v databázích
Řešení:
tilling arrays (Affymetrix)
mRNA sequencing (Illumina)
„Tilling“ arrays
sondy na sklíčku pokrývají kompletně určitou oblast
genomu popř. celý genom
repetitivní sekvence nejsou pokryty (před návrhem sond jsou
odstraněny pomocí programu „RepeatMasker“)
sondy: oligonukleotidy
např: 14 arrays, každé obsahuje 2x 3 250 000 sond
25 bazí sonda, PM a MM, mezera mezi sondami 10 bazí
po hybridizaci s fluorescenčně značenou cRNA „svítí“ sondy, které představují
transkribovaná místa ve studované oblasti (genomu)
sondy v místech „bez transkripce“ mají intenzitu fluorescence na úrovni pozadí
lze detekovat nové exony, jejich alternativní sestřih
mRNA sequencing
objevování nových transkriptů pomocí Illumina sekvenační technologie
není potřeba navrhovat, tisknout nebo syntetizovat sondy
mRNA first strand cDNA double-stranded cDNA fragmentace
sekvenace (Illumina technologie) ligace adapterů
mRNA sequencing