Cvičení z AC 2011 12. – 14. 12. 2011, BFÚ Vyučující: Mgr. Karel Souček, Ph.D.; Mgr. Zuzana Pernicová; Mgr. Radek Fedr Č. Učo Student Skupina A) 1. 151062 Nešporová, Kristina 2. 324025 Bezděková, Renata 3. 356432 Bogorová, Jana 4. 184431 Bujoková, Barbora 5. 270568 Machát, Radek Skupina B) 6. 386873 Menšíková, Markéta 7. 356874 Potočková, Hana 8. 269877 Pyszková, Michaela 9. 381745 Toporcerová, Veronika 10. 323468 Vrbiniaková, Jana Den 1 – středa 12.12.2012 hod A) B) 9-11 BD FACS Calibur & BD Aria II Sorp 4L, základy obsluhy a kalibrace 11-13 - Fucci cells, sběr, měření, sorting, analýza - ovlivnění buněk pro analýzu buněčného cyklu 13-15 - ovlivnění buněk pro analýzu buněčného cyklu - BD FACS Calibur & BD Aria II Sorp 4L, základy obsluhy a kalibrace 15-17 - Fucci cells, sběr, měření, sorting, analýza Den 2 – čtvrtek 13.12.2012 hod A) B) 9-11 Sběr buněk a značení povrchvých antigenů 11-13 Detekce, analýza a separace na základě exprese povrchových znaků Sběr a fixace buněk pro analýzu buněčného cyklu 13-14 Demonstrace přístroje MUSE od firmy Merc/Millipore – obě skupiny dohromady – detekce buněčné viability 14-16 Značení buněk, měření a analýza buněčného cyklu Den 3 – pátek 14.12.2012 A) B) 9-11 Sběr buněk a značení povrchových antigenů 11-13 Sběr a fixace buněk pro analýzu buněčného cyklu Detekce, analýza a separace na základě exprese povrchových znaků 13-15 Značení buněk, měření a analýza buněčného cyklu Protokol 1 Fucci 8 buňky, sběr, měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenčních proteinů - pouze demonstrace Protokol 2 Ovlivněnní buněk LAPC-4 pro analýzu buněčného cyklu - každý sám zpracuje dva vzorky – 1) kontrola (vehicle) a 2) cdk2 inhibitor III CVT-313 Protokol 3 LAPC-4 buňky, sběr, fixace, barvení Vindelovým roztokem, měření a analýza buněčného cyklu - každý sám zpracuje 2 vzorky – 1) kontrola (vehicle) a 2) curcumin Protokol 4 E2, cE2 buňky, sběr, multibarevné značení povrchových molekul CD133/CD44 a viability, měření a analýza fenotypu, sorting, kontrola kvality - každý sám zpracuje 2 vzorky – E2, cE2 linie Protokol 1 – model HeLa 8 Fucci cells – měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenční próby Cíl - cílem experimentu je seznámit se s modelovou buněčnou linií HeLa 8 Fucci, která umožňuje analýzu buněčného cyklu na živých buňkách bez potřeby fixace a značení - tento experiment bude demonstrační – bude Vám názorně předvedeno, jak se zpracovávají buňky pro tento typ analýzy, což využijete při přípravě dalších experimentů během tohoto cvičení - demonstrace měření proběhne na přístroji BD FACS Aria II Sorp - ukázka vyhodnocení dat bude provedena pomocí programu FlowJo Teorie Buněčná linie HeLa 8 Fucci - buněčná linie HeLa – lidská permanentní buněčná linie odvozená z karcinomu děložního čípku - nejstarší a jedna z nejčastěji používaných lidských buněčných linií - Fucci próba (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) – umožňuje vizualizovat progresi buněčného cyklu u živých buněk - buňky s Fucci ve fázi G1 emitují červené světlo, ve fázi S/G2/M zelené světlo - více – viz pdf. souboru uložené ve studijních materiálech http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867408000548 (viz studijní materiály) Tento experiment bude pouze demonstrován cvičícími Materiál - připravená buněčná line HeLa 8 Fucci - roztok PBS+EDTA – EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) je chelatační činidlo, které mimo jiné vychytává Ca^2+ ionty, čímž rozrušuje mezibuněčné spoje - trypsin - pankreatický enzym (serinová proteáza), štěpí amidové a esterové vazby argininu a lysinu - působení trypsinu uvolňuje adherentní buňky od kultivačního povrchu - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - PBS – oplach buněčné suspenze Postup: Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – 1-2 minuty nechat působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 1-2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - misku opláchnout 1 ml PBS, přenést do zkumavky k buněčné suspenzi - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 1 ml PBS - stočit 200g 5 min - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 300 ml PBS a měřit Výsledky Popište postup měření buněčného cyklu u této linie + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo Protokol 2 – ovlivnění buněčné LAPC-4 inhibitorem cdk2 CVT-313 Cíl - cílem experimentu je ovlivnit buněčnou linii LAPC-4 inhibitorem cyklin dependentní kinázy II (cdk2) CVT-313 - působení inhibitoru 24-48 hodin vede k deregulaci buněčného cyklu (změna distribuce buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu) - ovlivněné buňky budou následně zafixovány a nabarveny pro analýzu buněčného cyklu Teorie Buněčná linie LAPC-4 - lidská permanentní buněčná linie ustanovená z myšího xenograftu - buňky izolované metastáz v lymfatických uzlinách pacienta s karcinomem prostaty - přímá subkutánní injikace nádorových buněk získaných z pacienta s pokročilým stádiem karcinomu prostaty do myší (Drs. Robert Reiter and Charles Sawyers) - produkují PSA, mají wt androgenní receptor - růst nádorů a metastázování závislé na hormonech Cdk2 a její inhibice - cdk2 – cyklin-dependentní kináza 2 - regulace buněčného cyklu se účastní komplexy cyklinů a cyklin-dependentních kináz - serin/threoninová protein kináza - aktivita cdk2 je nejvyšší během S fáze a G2 fáze buněčného cyklu - cdk2 je aktivována interakcí s cyklinem E během rané fáze syntézy DNA (buňka může projít z G1 fáze do fáze S) - následně je aktivována cyklinem A během pozdní fáze replikace DNA – řídí přechod z S fáze do G2 fáze (mitózy) - inhibovaná inhibitorem cyklin-dependentních kináz p21^Cip1/Waf http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Cell_Cycle_And_Its_Regulation.htm - CVT-313, cdk2 inhibitor III (238803, Merck) – analog purinu - silný, selektivní, reversibilní, ATP-dependentní inhibitor Cdk2 (inhibuje její aktivitu) - in vitro indukuje zástavu buněčného růstu - primární cíl – komplexy Cdk2/cyklin A, Cdk2/cyklin E - rozpustný v DMSO Materiál - zásobní roztok inhibitoru o koncentraci 10mM rozpuštěný v DMSO - sterilní DMSO - sterilní špičky, pipety pro práci v laminárním boxu - připravené 2 misky 60 mm s buněčnou linií LAPC-4 (CO[2] inkubátor) - miska 1 – kontrola – ovlivněná pouze rozpouštědem (DMSO, vehicle) – přidá se stejný objem, jako objem přidávaného curcuminu - miska 2 – ovlivnění curcuminem – výsledná koncentrace 2.5 mM / 10 mM Výpočet - zásobní koncentrace inhibitoru CVT-313 = 10 mM - výsledná koncentrace na buňkách: - skupina A – 48 hodin treatment – koncentrace inhibitoru 2.5 mM - skupina B – 24 hodin treatment – koncentrace inhibitoru 10 mM - objem média v miskách = 4 ml - Dopočítejte, jaký objem zásobního roztoku inhibitoru CVT-313 a DMSO budete přidávat: Práce probíhá sterilně v laminárním boxu, každý student pracuje se dvěma vzorky (kontrola, ovlivnění inhibitorem) Postup - v laminárním boxu připravit sterilní špičky a pipety - přeneste buňky z CO[2] inkubátoru do laminárního boxu - do misky 1 (vehicle) přidat vypočítaný objem sterilního DMSO (mikrozkumavka 1) - do misky 2 (ovlivnění curcuminem) přidat vypočítaný objem zásobního roztoku curcuminu (mikrozkumavka 2) - médium v miskách opatrně a jemně promíchat - misky s buňkami po ovlivnění uložit zpět do CO[2] inkubátoru - inkubace s inhibitorem 24 hodin (skupina B) nebo 48 hodin (skupina A) Po příslušné době inkubace bude následovat nesterilní odběr vzorků, fixace a značení buněk na analýzu buněčného cyklu (viz. protokol 3) Výsledky Stručně popište vliv inhibitoru na morfologii a viabilitu buněčné linie PLAPC-4 v době odběru pro analýzu buněčného cyklu (mikroskopické pozorování). Protokol 3 3.A Sběr, fixace a značení buněk LAPC-4 po ovlivnění inhibitorem cdk2 pro analýzu buněčného cyklu Cíl: - cílem je připravit buňky LAPC-4 ovlivněné inhibitorem cdk2 pro analýzu buněčného cyklu - buňky budou nesterilně odebrány, zafixovány a následně bude naznačena DNA pomocí barvícího roztoku s propidium jodidem - vzorky budou analyzovány na přístroji BD Aria II Sorp - výsledky budou vyhodnoceny pomocí programu FlowJo Materiál: - LAPC-4 buňky - 1x 60 mm miska - kontrola - 1x 60 mm miska – cdk2 inhibitor 2.5 mM / 10 mM, ovlivnění 24/48 h - roztok PBS+EDTA - trypsin - nesterilní médium se sérem - PBS - 70% EtOH – fixace buněk - Vindelův roztok – značení pro buněčný cyklus (viz níže) - zkumavky pro FACS - nesterilní špičky, pipety Příprava vzorků Práce probíhá nesterilně, každý student pracuje s vlastními vzorky (kontrola, ovlivnění inhibitorem) Sběr vzorků ! před samotným odběrem si každý prohlédne své dva vzorky pod mikroskopem a doplní do protokolu č.2 výsledky pozorování! - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – 1-2 minuty nechat působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat s termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 1-2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - celý objem misky přenést pipetou do připravené FACS zkumavky (zkumavka A = kontrola, zkumavka B = ovlivněné buňky) - každou misku opláchnout 1 ml PBS, přenést do zkumavky k buněčné suspenzi Fixace buněk - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat ve 2 ml PBS - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet dobře rozsuspendovat ve 200 ml PBS - přidat 3,5 ml 70% EtOH, dobře promíchat několikanásobným převrácením zavřené zkumavky - fixace v EtOH – minimálně 30 min 4^oC, může zůstat i několik dní ve 4^oC Barvení pomocí Vindelova roztoku - buňky fixované v EtOH stočit 200g 5 min - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat ve 3 ml PBS - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat ve 300 ml Vindelova roztoku - barvit 30 min 37^oC a měřit Vindelův roztok (Handbook of flowcytometry methods - J.P. Robinson, Willey-Liss 1993) 1M TRIS (pH 8) 1 ml RNAsa (Sigma R-5503) 1 mg TRITON (nebo NP-40) 100 ml NaCl 60 mg Propidium jodid 5 mg doplnit destilovanou vodou do 100 ml uchovávat při 4°C Pozn. Vindelův roztok lze použít i bez fixace buněk – pak se v podstatě analyzují jen jádra. V případě fixovaných buněk není nutné mít v roztoku detergent (stačí pouze roztok PI a RNAse). 3.B Měření a analýza buněčného cyklu Popište postup vlastního měření a zhodnocení výsledků, přiložte výsledky vyhodnocené v programu FlowJo a interpretujte získaná data (srovnání mikroskopického pozorování v době odběru s výsledky analýzy cyklu,…). Protokol 4. Vícebarevná analýza fenotypu u buněčné linie E2 a cE2, sorting Cíl - cílem experimentu je na živých buňkách značit povrchové molekuly CD133 a CD44 pomocí specifických primárních protilátek konjugovaných s fluorescenčními značkami - je důležité detekovat expresi těchto povrchových molekul pouze na živých buňkách, proto současně se značením těchto dvou znaků bude detekovaná i viabilita pomocí speciálního fluorescenčního kitu - celkem tedy budeme značit 3 znaky a detekovat 3 fluorescenční spektra 4.A Odběr buněk a značení specifickými protilátkami Buněčné linie E2 a cE2 - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2903072/?tool=pubmed (viz studijní materiály) - myší buněčné linie odvozené z adenokarcinomu prostaty - izolované z myší s kondicionální delecí genu pro PTEN, což vede ke spontánnímu rozvoji adenokarcinomu prostaty - line E2 – závislá na androgenech - linie cE2 – linie nezávislá na androgenech, izolovaná z myši po kastraci Povrchové molekuly CD133 a CD44 - prokázány jako charakteristické znaky nádorových kmenových buněk (NKB) mimo jiné i u adenokarcinomu prostaty - NKB - subpopulace nádorových buněk, které jsou pravděpodobně zodpovědné za progresi nádorového onemocnění a tvorbu metastáz - vlastnosti podobné kmenovým buňkám – schopnost sebeobnovy a tvorby jak dalších maligních buněk, tak i nemaligních prekurzorových buněk - pomalu cyklující buňky, zvýšená exprese antiapoptotických molekul a také molekul zodpovědných za multilékovou rezistenci (ABC transportéry), proto jsou rezistentní k běžně aplikované chemoterapii - CD44 - povrchová molekula zapojená do procesů proliferace, diferenciace, migrace, angiogeneze a dalších - u mnoha nádorových onemocnění je zvýšená exprese CD44 spojena s horší prognózou - má několik ligandů – osteopontin, fibronectin, collagen, hyaluronate - u nádorových onemocnění prostaty je považován za marker jak nenádorových, tak nádorových kmenových buněk - CD133 (Prominin-1) - 5x transmembránový glykoprotein - původně marker primitivních hematopoietických kmenových a progenitorových buněk - bylo prokázáno, že CD133 je také markerem kmenových buněk v jiných tkáních, a také nádorových kmenových buněk Použité protilátky - primární protilátky - anti-mouse CD133 (Prominin-1) PE - BioLegend 141204 - rat IgG2a kappa - anti-mouse CD44 APC-Cy7 - BioLegend 103028 - rat IgG2b kappa - izotypové kontroly - PE Rat IgG2a kappa isotype control – BioLegend 400508 - APC/Cy7 rat IgG2b kappa isotype control – BioLegend 400624 - značení viability - LIVE/DEAD Yellow fixable cell stain kit - informační materiály k použitým protilátkám a kitu pro detekci viability – viz studijní materiály Další materiál - nesterilní PBS - nesterilní roztok 1% BSA – před začátkem odběru připravit 10 ml 1% BSA ředěného v PBS připraveného zředěním 20% zásobního roztoku BSA Dopočítejte: pro získání 10 ml 1% BSA přidat ……………… ml 20 % BSA do ……………. ml PBS - nesterilní FACS zkumavky, špičky, pipety Vzorky: - pracujeme se 2 buněčnými liniemi – E2 a cE2 - pro každou linii budou připraveny 2 vzorky - specifické značení (CD) - isotypová kontrola (ISO) - vzorky: 1 – E2 ISO – IgG2a PE / IgG2b APC-Cy7 / yellow viability 2 – E2 CD – CD133 PE / CD44 APC-Cy7 / yellow viability 3 – cE2 ISO – IgG2a PE / IgG2b APC-Cy7 / yellow viability 4 – cE2 CD – CD133 PE / CD44 APC-Cy7 / yellow viability Práce probíhá nesterilně, každý student připraví celkem 4 vzorky. Postup: 1. příprava vzorků - 1x 60 mm miska E2 buněk - 1x 60 mm miska cE2 buněk - zpracovávejte obě misky zároveň - odsát médium - oplach 3 ml PBS+EDTA – inkubace 10 minut 37^oC linie cE2, 1 min 37^oC linie E2 (inkubátor) - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – inkubace až 5 minut 37^oC (suchý termostat, průběžně pozorovat, zda se již buňky uvolňují od kultivačního povrchu) - přidat 2,5 ml média se sérem – inaktivace trypsinu - celou suspenzi přenést do připravených nesterilních zkumavek - E2 buňky – zkumavka A - cE2 buňky – zkumavka B - misky opláchnout 1 ml PBS – přenést do příslušné zkumavky - zkumavky s buněčnou suspenzí stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 1 ml PBS s 1% BSA - každou ze zkumavek A a B rozdělit na poloviny do dvou zkumavek určených pro měření na cytometru - zkumavka A (E2) – vzorky č. 1 a 2 - zkumavka B (cE2) – vzorky č. 3 a 4 - do každé zkumavky přidat 1 ml 1% BSA - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant a přidat příslušné protilátky ředěné v 1% BSA 2. Značení protilátkami CD133 a CD44 - do každého vzorku se přidá 100 ml 1% BSA s příslušnými protilátkami nebo isotypovými kontrolami - celkem máme 4 vzorky, 2 pro specifické značení a 2 pro isotopovou kontrolu, nachystáme si tedy 200 ml od každého ředění - ředění protilátek – CD133 PE 1:100 CD44 APC/Cy7 1:50 IgG2a PE 1:100 IgG2b APC/Cy7 1:50 Dopočítejte: - 1. mikrozkumavka ISO – do 210 ml 1% BSA přidáme ………… ml IgG2a PE ..……… ml IgG2b APC/Cy7 2. mikrozkumavka specifické značení – do 210 ul 1% BSA přidáme ………… ml CD133 PE ………… ml CD44 APC/Cy7 - do zkumavky 1 a 3 přidáme 100 ml z mikrozkumavky 1 (izotypová kontrola, ISO) - do zkumavky 2 a 4 přidáme 100 ml z mikrozkumavky 2 (specifické značení, CD) - všechny vzorky důkladně propipetovat - inkubace 30 min v lednici - po 30 min přidat ke všem vzorkům 1 ml čistého PBS - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet ve všech mikrozkumavkách rozsuspendovat ve 100 ul PBS s naředěnou značkou pro viabilitu 3. značení viability - ředění značky pro viabilitu – LIVE/DEAD yellow cell stain kit – ředění 1:500 - do každého vzorku se přidá 100 ml naředěné značky, celkem máme 4 vzorky - vypočítat ředění značky pro viabilitu při ředění 1:1000 do 450 ml PBS přidat …………. ml značky na viabilitu - vzorky dobře rozsuspendovat v 100 ml naředěné značky - inkubovat 20 min v lednici - po 20 min přidat ke všem vzorkům 1 ml čistého PBS - stočit 200g 5 min - odsát supernatant - vzorky rozsuspendovat v 300 ml PBS a měřit/sortrovat - pokud vzorky nebudou hned měřeny, tak uložit na led nebo do lednice Protokol 4B. Imunofenotypová analýza linie E2 a cE2, sorting, vyhodnocení výsledků Popište způsob analýzy a sortingu, přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo, výsledky interpretujte.