#2 Metody a modely vývojové biologie Základní modely •Caenorhabditis elegans (háďátko) •Drosophila melanogaster (octomilka) •Danio rerio (zebrafish, dánio, zebřička) •Xenopus tropicallis/laevis (drápatka, frog) •kuře (Gallus domesticus, chick) •myš (Mus musculus, mouse) • Výhody a nevýhody jednotlivých modelů (parametry) •Je model v něčem jedinečný? •Jak moc je model přístupný genetické manipulaci? •Jak rychle je možno provést experiment? •Jak moc je model relevantní pro lidskou embryogenezi a medicínu? •Jak finančně náročné je pracovat s daným modelem? •Další parametry (vhodný pro large-scale screening?, vhodný pro in vivo imaging?, vhodný pro lineage tracing? atd.) Caenorhabditis elegans (worm) • •asi 1 mm velký hlíst •levný provoz •mutantní kmeny se mohou uchovávat jako zmražené •vhodný pro poznávání základních mechanismů vývoje a buněčných vztahů •omezená přenositelnost konkrétních poznatků (např. o funkci jednotlivých genů) na další modelové organismy a člověka – důvodem je značná fylogenetická vzdálenost a specifické funkce mnoha genů u C. elegans C elegans Caenorhabditis elegans •Nobelova cena 2002: •Sydney Brenner – otec C. elegans (lineage of C.elegans scientists) •John Sulston – zmapoval vývojové linie (kniha Common Thread) •Robert Horvitz – popsání prvních genů zodpovědných za apoptózu • •genom sekvenován 2002, asi 20 000 genů • •genetické manipulace - RNA interference (Nobelova cena 2006 – Andrew Fire and Craigh Mello) – ponoření, mikroinjekce nebo nakrmení bakteriema s patřičnou dsRNA •v ČR – skupina M. Asahina v Českých Budějovicích, M. Macůrková (Praha) •užitečné odkazy na: http://www.wormbase.org/ nebo http://www.wormbook.org/ • Caenorhabditis elegans C elegans lineages •Jedinečnost: omezený počet buněk (přesně 959 u hermafrodita a 1031 u samce) a přesné popsání jejich vzájemných vztahů (mateřská a dceřinná buňka), propojení (neurony) a osudů (diferenciace, migrace, apoptóza) • Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster 120px-Drosophila_melanogaster Drosophila melanogaster •klasický genetický model už od roku 1909 (Thomas Morgan) •vysoký stupeň poznání genetiky octomilek, nízké náklady a rychlý generační čas (2 týdny) je důvodem pro jejich využití ve vývojové biologii •genom sekvenován 2000 – pouze 4 páry chromozómu Drosophila culture Drosophila melanogaster •genetické modifikace: •(i) velké spektrum kmenů s přirozenými nebo indukovanými mutacemi, ktere se naakumulovaly v průběhu 100 let výzkumu octomilek •(ii) transgenní Drosophily s využitím P-elementu a pokročilých genetických technik •(iii) od roku 2000 i specifická rekombinace (knock-out a knock-in kmeny) •(iv) možnosti vytváření chimér a mozaik Drosophila mutants Drosophila melanogaster Drosophila larva Kutikula Drosophila hox genes Homeoboxové geny 400px-Hoxgenesoffruitfly_svg Roel Nusse, 2006 Danio rerio (zebřička, zebrafish) zebrafish Danio rerio (zebřička, zebrafish) •Výhody •obratlovec •velmi plodná •průhledná embrya •rychlý vývoj •vnější oplození a vývoj •jednoduchý systém •identifikovatelné, stereotypické neurony •možnost genetických manipulací • • Danio rerio – rychlá embryogeneze Genetické modifikace u Danio rerio Figure 1. Overview of target-selected mutagenesis in zebrafish. Ninety-nine adult male zebrafish were mutagenized by three to five consecutive treatments with 3 mM ENU, in accordance with (32). The mutagenized fish were crossed with wild-type females to give a nonmosaic F1 generation of fish. Sperm was isolated and cryopreserved from 2679 fertile F1 males. Genomic DNA was isolated, arrayed in PCR plates, and screened for mutations by nested PCR amplification of the target gene and subsequent DNA sequence analysis. After a particular mutation was identified, in vitro fertilizations (IVF) were performed to recover the F2 line carrying the mutation (12). Finally, mutations can be bred to homozygosity and analyzed for phenotypes. zebrafish transgenesis 1.Gain-of-funciton - overexprese – injekce mRNA do vajíčka nebo embrya 2.Loss-of-function: a)morpholina b)ENU mutageneze a skrínink c)embryonální kmenové buňky a homologní rekombinace podobně jako u myši – do budoucna Xenopus (drápatka) •X. laevis – klasický model, tetraploidní – genom není sekvenován a nejsou možné stabilní genetické modifikace •X. tropicallis – nově zaváděný druh, který umožňuje xenopus frog Xenopus (drápatka) •Výhody (modifikováno z Wikipedie): • • 1) X. laevis is primarily aquatic and can be maintained and bred easily in aquaria • •2) unlike most other amphibians, X. laevis happily feeds on "dead" organic material • •3) X. laevis is very hardy and tolerate a wide range of living conditions; and most importantly • •4) X. laevis can be induced to ovulate and mate anytime of the year following a simple injection of gonadotropic hormones. This discovery in the 1930's became the basis of a simple pregnancy test for humans and led to its worldwide distribution and use • •5. By the late 1950's and early 1960's more sensitive methods for detecting pregnancy were developed and X. laevis were no longer needed for this purpose. However by this time developmental biologists throughout the world had begun to exploit Xenopus embryos as a convenient model system. For the purpose of genetics, and some molecular studies, though, X. laevis is not the ideal system, in large part because it is effectively polyploid Životní cyklus drápatky (X. laevis) Xenopus life Cycle Genetické manipulace u X. laevis •GOF (gain-of-function) - overexprese proteinů – mikroinjekce mRNA pro „protein of interest“ do vajíčka nebo buněk časného embrya (podle místa mikroinjekce lze určit ve kterých buňkách k overexpresi dojde) •LOF (loss-of-function) – mikroinjekce anti-sense morpholino-oligonucleotides – specificky se váží na mRNA v místě prvního kodonu a brání tak translaci • morpholinos frogs zdvojení tělní osy indukované mikroinjekcí proteinu Wnt do ventrální blastomery kuře (chick) chicken Chicken embryo IMG_0118 Comparison to give a general idea of the size of a developing chicken embryo kuře (chick) •vývoj je blízký (i molekulárně) vývoji savců, včetně člověka •embryo snadno získatelné (jako vajíčko) a přístupné manipulaci (po odstranění skořápky J) •dobře popsaný klasický model, který zažívá nový rozmach s nástupem molekulárních technik •jako jeden z prvních použit pro lineage tracing (chiméra kuře x křepelka), buňky se liší tvarem jader • • Hackels table Chicken electroporation chick egg injection chicken electroporation Left, the lumen of an eight-somite chicken neural tube is filled with plasmid DNA (orange) to direct lacZ expression. Electrodes are placed on either side of the embryo and transfer into the right side of the neural tube (toward the positive pole; +) is achieved by applying 4 50-ms pulses of 15 V each. Right, after in ovo culture for 24 h, lacZ expression (dark blue) is strongly detected on the transfected side. Elektroporace kuřecí nervové trubice umožnila poznat jakým způsobem buňky během vývoje získávájí a udržují svou identitu chick olig2_mnr2 chick signal_model Fig. A - A model for early spinal cord development. The neural tube which will form the spinal cord is patterned into specific domains by multiple external signals which include a ventralizing Sonic Hedgehog (Shh) signal from the notochord (N) and floor plate (F), a dorsalizing BMP signal from the roof plate (R), and retinoic acid (RA) signaling from the adjacent somites (S). Cross section of the spinal cord of an embryonic day three chicken embryo stained with fluorescent antibodies. Shown here in red is the motor neuron progenitor domain (pMN), one of many precise domains established by earlier signaling events. The pMN domain is here labelled through the use of antibodies specific for Olig2, a critical regulator of motor neuron formation. Developing motor neurons emerging from the pMN are shown labelled in green. chicken electroporation no Myš •savec •z toho plyne, že embryonální vývoj je ze všech modelů nejpodobnější člověku •genom sekvenován •jedinečný díky možnostem genetických manipulací (transgenní myši) mouse-joke devbio8e-fig-01-15-0 Myš je velmi relevantní model pro studium lidské embryologie piebaldismus devbio8e-fig-01-15-0.jpg Myš - nevýhody •relativně dlouhý generační čas •embrya obtížně přístupná experimentální manipulaci – pouze v děloze matky •finančně náročný model mouseCD Transgenní myš mouse transgenesis Nobelova cena 2007 Mario R. Capecchi, Martin J. Evans and Oliver Smithies za „principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells“ Příprava myších kmenových buněk ES_cell_isolation Transgenní myš – state of the art: •knock-in myši – umožňují záměny genů, vnesení bodových mutací atd. • •kondicionální knock-out/in - myši založené na Cre-recombinázovém systému •a) pouze v určité tkáni/typu buněk •b) pouze po vnější stimulaci (tzv. inducibilní Cre), tj. v experimentálně určeném čase •c) náhodně – v určitém procentu buněk, využití pro lineage tracing Výhody a nevýhody jednotlivých experimentálních modelů vývojové biologie -summary devbio8e-fig-01-06-0 Srovnání jednotlivých modelů Evo-Devo approach devbio8e-fig-01-06-0.jpg Závěr: Pro obecné závěry je nejlepší modely kombinovat! mouse-frog imagesCA1PUVAO normal_frog_fly_crossed