jméno: obor: datum provedení: neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu a b c d (zakroužkujte) přílohy protokolu: graf: kalibrační přímka pro fotometrické stanovení DNA v UV oblasti OKRUHY K PŘÍPRAVĚ Primární struktura nukleových kyselin. Sekundární struktura nukleových kyselin. Denaturace nukleových kyselin. Absorbující složky nukleových kyselin, absorpční spektrum nukleových kyselin. Lambertův-Beerův zákon. Chemické výpočty. Návod v plném znění platí pro obory molekulární biologie, chemie, biochemie (pětihodinová a sedmihodinová cvičení). Biologické obory kromě molekulární biologie (tříhodinová cvičení): jen části A, B. Učitelské kombinace (čtyřhodinová cvičení): jen části A, B, C. PRINCIP ÚLOHY A. Izolace DNA Nukleové kyseliny se v buňkách vyskytují ve formě asociátů s bílkovinami (nukleoproteinů). Prvním izolačním krokem při přípravě preparátů nukleových kyselin je důkladná destrukce tkání nebo buněk. Existuje celá řada postupů, kterými lze oddělit složky nukleoproteinu - bílkoviny a jednotlivé druhy nukleových kyselin. Separace nukleových kyselin a bílkovin bývá často prováděna pomocí detergentů (nejčastěji dodecylsíranem sodným - SDS) ještě před extrakcí nukleových kyselin z tkáně. Také extrahovaný nukleoprotein lze dodatečně podrobit deproteinaci - nejčastěji se používá fenol (který současně inhibuje nukleasy) nebo směs chloroformu a isoamylalkoholu. DNA se z roztoků naopak poměrně selektivně precipituje např. isopropanolem. V této části úlohy bude provedena extrakce nukleoproteinu z bakteriálních buněk v přítomnosti dodecylsíranu sodného, deproteinace produktu chloroformem a vysrážení nukleové kyseliny z vodného roztoku ethanolem. B. Identifikace DNA obsažené ve vzorku specifickou barevnou reakcí V kyselém prostředí hydrolyzují nukleové kyseliny na směs nukleotidů a nukleosidů (hydrolýza fosfoesterických vazeb), z nichž zejména purinové nukleotidy a nukleosidy dále snadno odštěpují cukernou složku (hydrolýza N-glykosidické vazby spojující cukernou složku s bází). RNA obsahuje jako cukernou složku ribosu, DNA 2´-deoxyribosu. Ribosu a 2´-deoxyribosu lze navzájem odlišit na základě rozdílného zbarvení, které tyto sacharidy poskytují při reakci s difenylaminem po mineralizaci koncentrovanou kyselinou. C. Stanovení čistoty DNA spektrofotometrií v UV oblasti, denaturace DNA Aromatické heterocykly bazí nukleových kyselin absorbují UV záření s maximem v okolí vlnové délky 260 nm. Jestliže se nukleové kyseliny nacházejí ve směsi s bílkovinami, je tvar charakteristického absorpčního spektra nukleových kyselin (s maximem při vlnové délce 260 nm) přítomností bílkovin zkreslen, neboť i bílkoviny absorbují UV záření v této oblasti vlnových délek. Přítomnost nukleových kyselin se však i ve spektru vzorku obsahujícího větší množství bílkoviny projevuje nezřetelným absorpčním maximem nebo alespoň prodlevou v okolí vlnové délky 260 nm. Čistotu nukleové kyseliny ve vzorku vyjadřují dva základní poměry absorbancí a to poměr A[260]/A[280] a A[260]/A[230]. Poměr A[260]/A[280] udává míru kontaminace vyizolované nukleové kyseliny proteiny. Pro čistou DNA by měl být poměr 1,7-1,9 a pro čistou RNA 1,8-2,0. Poměr A[260]/A[230] udává míru znečištění nukleové kyseliny nízkomolekulárními látkami (fenol, EDTA, huminové kyseliny, atd.) a rovněž proteiny (absorbance peptidové vazby). Pro čistou nukleovou kyselinu by měl být poměr vyšší než 2. Postup izolace DNA by měl být natolik šetrný, aby nedocházelo k její denaturaci (rozpadu nativní dvouřetězové struktury). Sekundární struktura nukleové kyseliny silně ovlivňuje absorpci UV záření - u dvouřetězových nukleových kyselin (tzn. především DNA) jsou heterocyklická jádra bazí pravidelně uspořádána uvnitř dvoušroubovice a takto uspořádaná struktura absorbuje méně než neuspořádaná jednořetězová struktura (kromě většiny RNA se jako jednořetězová vyskytuje denaturovaná DNA). Při rozpadu dvoušroubovice a vzniku nahodilého uspořádání dochází ke vzrůstu absorbance při vlnové délce 260 nm. Pomocí denaturace (nejčastěji tepelné denaturace – zahřátím vzorku DNA na vyšší teplotu a jeho následným rychlým ochlazením) lze zjistit, zda má vyizolovaný preparát vlastnosti nativní DNA. D. Fotometrické stanovení DNA v UV oblasti Schopnosti nukleových kyselin absorbovat UV záření s absorpčním maximem při vlnové délce kolem 260 nm lze využít k jejich kvantitativnímu stanovení. V praxi se využívá empiricky zjištěného vztahu, kdy u nativní (dvouřetězové) DNA A[260] = 1,0 odpovídá koncentraci 50 μg/ml a u denaturované (jednořetězové) DNA a RNA A[260] = 1,0 odpovídá koncentraci 40 μg/ml. Biopolymery záření nejen absorbují, ale také rozptylují. Tím zdánlivě roste hodnota jejich absorbance. Nejjednodušší korekce rozptylu záření vychází z představy, že hodnotu rozptylu (zdánlivé absorbance) změřenou v oblasti, kde biopolymer záření již neabsorbuje, lze odečíst od hodnot nepříliš vzdálené absorpční oblasti. Nukleové kyseliny již neabsorbují při vlnové délce 330 nm, jejich A[330] je tedy hodnota rozptylu, zdánlivé absorbance, kterou lze odečítat od naměřených hodnot absorbance [ ]a tím provést korekci[.] měření. PRAKTICKÁ ČÁST A. Izolace DNA Materiál a vybavení: bakteriální buňky (1g vlhkého peletu) roztok EDTA-NaCl (0,15 mol.l^-1 EDTA + 0,1 mol.l^-1 NaCl, pH 8,0) roztok lysozymu (10 mg.ml^-1) 25% roztok sodiumdodecylsulfátu (SDS) 5 mol.l^-1 chloristan sodný směs chloroform - isoamylalkohol (24:1) 95% ethanol fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) pipety, dávkovače, termostat, odměrné válce, centrifuga, centrifugační kyvety, vortex, zkumavka, ledová lázeň Postup: K peletu bakteriálních buněk v centrifugační zkumavce přidejte 1 ml roztoku EDTA-NaCl, rozmíchejte na vortexu. K suspenzi připipetujte 2 ml roztoku EDTA-NaCl, 130 ul roztoku lysozymu a směs inkubujte 15 min. při 37 ^oC (každých 5 minut promíchejte). Ke směsi přidejte 260 ul 25% roztoku SDS, opatrně promíchejte a inkubujte při 60 ^oC po dobu 10 minut (každé 2 minuty směs promíchejte). Míchejte opatrně, abyste zabránili nadměrnému pěnění. Uvolnění nukleové kyseliny z buněk se projeví zvýšením viskozity roztoku a zákalem. Poté směs zchlaďte na okolní teplotu pod tekoucí studenou vodou, přidejte 1,2 ml 5 mol.l^-1 chloristanu sodného, promíchejte a v digestoři ke směsi přidejte 5,4 ml směsi chloroform - isoamylalkohol (24:1). Obsah zkumavky důkladně promíchejte a centrifugujte 20 minut při 9000 ot/min. Po centrifugaci se vytvoří tři vrstvy (spodní organická, střední s denaturovanými proteiny a horní vodná obsahující nukleové kyseliny). V digestoři opatrně odeberte (Pasteurovou pipetou nebo dávkovačem) horní vodnou vrstvu do nové 15 ml centrifugační zkumavky a nukleovou kyselinu vysrážejte přidáním dvojnásobného objemu 95% ethanolu. Směs opatrně promíchejte převracením zkumavky, během kterého uvidíte srážející se vlákna nukleové kyseliny. Poté směs centrifugujte 10 minut při 9000 ot/min. Odlijte supernatant, zkumavku obraťte na tampón buničiny a nechte vytéci veškerý roztok. Pelet rozpusťte v 0,5 ml fyziologického roztoku. Odeberte 50 ul rozpuštěného peletu a přidejte k němu 2 ml fyziologického roztoku. Tento vzorek uschovejte v ledové lázni pro použití v části C úlohy. Zbytek rozpuštěného peletu (cca 0,5 ml) použijte v části B úlohy. Centrifugační zkumavky je nutno přesně vyvážit! Vyvažování kyvet a spuštění centrifugy provádějte pouze pod dohledem personálu laboratoře. PRAKTICKÁ ČÁST B. Identifikace DNA specifickou barevnou reakcí Materiál a vybavení: standardní roztok deoxyribosy (0,02 mg.ml^-1) standardní roztok ribosy (0,02 mg. ml^-1) standardní roztok DNA (1 mg. ml^-1 fyziologického roztoku) standardní roztok RNA (1 mg. ml^-1 fyziologického roztoku) roztok nukleoproteinu (získaný v části A úlohy) fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) difenylaminové činidlo (roztok difenylaminu v kyselině octové a kyselině sírové) zkumavky, pipety,dávkovače, odměrný váleček, Pasteurova pipeta, kahan a trojnožka nebo vařič, hrnec, kruhový stojan na zkumavky Postup: Do zkumavek dávkujte podle rozpisu: zkumavka č. 0,5 ml zbarvení 1 fyziologický roztok 2 deoxyribosa 3 ribosa 4 DNA 5 RNA 6 roztok nukleoproteinu* *cca 0,5 ml, rozpuštěný pelet získaný v části A úlohy Ke vzorkům přidejte cca 1,5 ml difenylaminového činidla a zahřívejte je 10 minut na vroucí vodní lázni. Pozorujte zbarvení vzorků. Difenylaminové činidlo nepipetujte – odměřujte válečkem nebo dávkujte pomocí Pasteurovy pipety! Vyhodnocení: Do protokolu uveďte tabulku doplněnou v posledním sloupci. Porovnejte zbarvení roztoku nukleoproteinu se zbarvením kontrolního vzorku (fyziologický roztok) a standardních roztoků ribosy, deoxyribosy, RNA a DNA. Uveďte, zda se zdařilo identifikovat přítomnost DNA ve vyizolovaném produktu: PRAKTICKÁ ČÁST C. Stanovení čistoty DNA spektrofotometrií v UV oblasti, denaturace DNA Materiál a vybavení: roztok nukleoproteinu (získaný v části A úlohy – zředěný vzorek) fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) zkumavky, pipety, fotometr, UV- propustné kyvety , kahan a trojnožka nebo vařič, hrnec, kruhový stojan na zkumavky, ledová lázeň, filtrační papír, nálevka Postup: U zředěného roztoku peletu získaného v části A úlohy proměřte absorpční spektrum v oblasti vlnových délek 230 – 300 nm proti fyziologickému roztoku a srovnejte je se spektrem vyizolovaného nukleoproteinu uloženým v počítači. Měření provádějte v UV plastových kyvetách. Jestliže dosahují absorbance vzorku v kterékoliv části spektra hodnot vyšších než cca 0,6, je nutno vzorek dále zředit fyziologickým roztokem (postačuje ředění odhadem). Ve spektru vzorku obsahujícího dostatečné množství DNA se objevuje absorpční maximum v okolí vlnové délky 260 nm; pokud je absorpční maximum v okolí vlnové délky 280 nm, obsahuje preparát převážně bílkoviny. Vzorek nevyhazujte, do dvou zkumavek pipetujte po 1 ml vzorku a zkumavku dobře uzavřete Jednu zkumavku zahřívejte 15 minut na vroucí vodní lázni a poté její obsah rychle ochlaďte v ledové lázni.. Proměřte absorpční spektrum obou vzorků v oblasti vlnových délek 230 – 300 nm proti fyziologickému roztoku. Zapište absorbance nativního (nezahřívaného) vzorku při vlnových délkách 230 nm, 260 nm a 280 nm. a absorbanci denaturovaného (zahřívaného a ochlazeného) vzorku při 260 nm. Měření provádějte v UV plastových kyvetách. Vyhodnocení: Do protokolu uveďte tabulku doplněnou o zjištěné experimentální údaje (A[230, ]A[260, ]A[280]), vypočtěte poměry A[260]/A[230 ]a A[260]/A[280 ]a určete přibližné složení (obsah nukleových kyselin, obsah bílkovin) ve vyizolovaném preparátu. (Předpoklad: preparát neobsahuje další složky absorbující UV záření při vlnových délkách 260 a 280 nm.) A[230] A[260] A[280] A[260]/A[230] A[260]/A[280] Popište čistotu získaného preparátu (obsah DNA, bílkovin, nízkomolekulárních látek): Uveďte absorbance při vlnové délce 260 nm: A[260] – nativní vzorek A[260] – denaturovaný vzorek Získaný výsledek vysvětlete: PRAKTICKÁ ČÁST D. Fotometrické stanovení DNA v UV oblasti Materiál a vybavení: standardní roztok DNA (1 mg.ml^-1 fyziologického roztoku) neznámý vzorek DNA pro kvantitativní analýzu fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) zkumavky, pipety, dávkovače, odměrná baňka 10 ml, vortex, fotometr, UV-propustné kyvety Postup: Standardní roztok DNA (1 mg.ml^-1) zřeďte tak, že 0,25 ml standardního roztoku DNA doplníte v odměrné baňce fyziologickým roztokem na objem 10 ml a dobře promícháte. Stejným způsobem zřeďte neznámý vzorek DNA. Podle tabulky připravte jednak sadu roztoků vzorků o šesti známých koncentracích DNA k sestrojení kalibrační závislosti (zkumavky 1-6) a dále 2 paralelní zkumavky s roztokem DNA o neznámé koncentraci (zkumavky 7-8). Obsah zkumavek promíchejte na vortexu. Obsah zkumavky č. 1 (fyziologický roztok - nulová koncentrace DNA) použijete později jako slepý vzorek. zkumavka č. pipetovaný objem c(DNA) [mg.ml^-1] A[260] A[330] A[260] [korigovaná ] zředěný standardní roztok DNA [ml] zředěný neznámý vzorek DNA [ml] fyziol. roztok [ml] 1 0 0,0 2,5 0,000 0,000 0,000 0,000 2 0,5 0,0 2,0 3 1,0 0,0 1,5 4 1,5 0,0 1,0 5 2,0 0,0 0,5 Ø A[260-korigovaná ] 6 2,5 0,0 0,0 7 0,0 2,0 0,0 ? 8 0,0 2,0 0,0 ? Změřte absorbanci vzorků při vlnových délkách 260 a 330 nm proti slepému vzorku (zkumavka č.1). Měření provádějte v UV plastových kyvetách. Prostudujte spektra nativní (dvouřetězové) a denaturované (jednořetězové) DNA uložená v počítači (zapište koncentraci vzorků a jejich absorbanci při vlnové délce 260 nm). koncentrace [mg.ml^-1] A[260] e (uveďte fyzikální rozměr!) ds-DNA ss-DNA Vyhodnocení: Vypočítejte koncentrace DNA ve zkumavkách č. 2-6, výsledky doplňte do tabulky. Tabulku dále doplňte korigovanými hodnotami A[260 ] (A[260-korigovaná]) vypočtenými podle vzorce: A[260-korigovaná ] = A[260] - A[330] Vypočítejte průměr absorbancí ve zkumavkách č. 7-8 a doplňte do tabulky. Sestrojte kalibrační graf (závislost A[260-korigovaná] na koncentraci DNA ve zkumavce). Z rovnice kalibrační přímky, kterou zobrazíte v grafu, pak vypočítejte koncentraci DNA ve zředěném neznámém vzorku (výpočet uveďte níže): Vypočítejte, kolikrát byl zředěn původní neznámý vzorek. Ředění neznámého vzorku: krát Tímto faktorem vynásobte fotometricky zjištěnou koncentraci DNA a získáte koncentraci DNA v původním neznámého vzorku. Výsledek: koncentrace DNA v neznámém vzorku: c = mg.ml^-1 Ze směrnice přímky odečtěte miligramový absorpční koeficient DNA při vlnové délce 260 nm: ε[260] (doplňte fyzikální rozměr) : Určete, zda standardní roztok DNA obsahoval nativní nebo denaturovanou DNA: KONTROLNÍ LIST jména: obor: datum provedení: neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu a b c d (zakroužkujte) ÚLOHA 4C A[230] A[260] A[280] A[260] – nativní vzorek A[260] – denaturovaný vzorek Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 4D zkumavka č. A[260] A[330] 1 0,000 0,000 2 3 4 5 6 7 8 koncentrace [mg.ml^-1] A[260] ds-DNA ss-DNA Podpis vedoucího cvičení: