C5060-Metody chemického výzkumu 14. 12. 2012
VyuVyužžititíí spojenspojeníí a vývoja vývoj
LC/MS metodLC/MS metod
Blanka Vrbková
2
HPLC
• před 35 lety; nejrozsáhlejší separační technika – kvalitativní a kvantitativní
• Rovnováha mezi dvěma fázemi – mobilní (MF) a stacionární (SF). Separace na základě
fyzikálně chemických jevů ve vybraném systému.
Dělení chromatografie:
• Způsob provedení - kolonové uspořádání
- uplatňuje se lineární oblast adsorpční
izotermy
• Pracovní provedení - eluční technika
- jednorázové zavedení směsi
s kontinuálním tokem
• Princip separace – rozdělovací LC
• → různá afinita ke SF, různá distribuce
mezi MF a SF, a tím různá zádrž (na SF) a
zpoždění (v systému)
• Účel - analytická
Schéma zapojení kapalinové chromatografie
3
• Termodynamické a kinetické aspekty separace
→ vlivy, které ovlivňují rozšiřování (rozmývání) zón během postupu kolonou →
šířky píku v chromatogramu
→ vlivy, které ovlivňují velikost interakce mezi sorbentem a analytem, retence,
retardace, rychlost pohybu analytu kolonou, rozdíl v tR, dělení analytů od sebe
navzájem
4
uC
u
B
AH ⋅++=
→ vliv rychlosti MF na rozšiřování zón →
→ A = Vířivá difúze
B = Podélná difúze
C = Odpor přenosu hmoty ve SF a MF
u = lineární rychlost MF
N
L
H =
)(ufH =
Faktor účinnosti
N = 16 (tR/w)2
Rozlišení je fcí druhé odmocniny N → významnost účinnosti při rozlišení
bývá nadhodnocené! Velké změny účinnosti ovlivní minimálně hodnotu
rozlišení.
Zlepšení účinnosti – prodloužením kolony, snížením velikosti částic/zrna,
poklesem rychlosti toku MF, minimalizací mrtvých objemů při separaci,
teplotou, viskozitou.
Cíl Faktor Kontrola
Faktor selektivity
α = k2/k1
α → 1! Kdy malé změny mají velký vliv na hodnotu rozlišení.
Zlepšení selektivity – změnou složení MF či SF, příp. další potenciální
proměnné – pH a teplota
Faktor kapacity
k = (tR-t0)/t0
V praxi nabývá hodnot k ≈ 2-10, obvykle zádrž 2*t0! Pro hodnoty k < 1
výrazně omezuje rozlišení. Naopak se vzrůstající hodnotou kapacitního
faktoru se zlepšuje i rozlišení ( k = 20, není již zlepšení výrazné).
Zlepšení kapacitního faktoru – změnou MF nebo SF (změna eluční síly).






+
⋅




 −
⋅=
1
1
4 k
kN
RS
α
α
!
5
• Eluční křivka neboli koncentrační profil analytu v zóně = chromatogram
• Asymetrie
(A) gaussovský pík, (B) chvostování/tailing, (C) hrnutí/frontování
A
B
AS =
Výborné - AS = 1,00-1,05
Přijatelné - AS = 1,2
Nevyhovující - AS = 2
• Distribuční konstanta
( )
( )
( )
( ) S
M
Mi
Si
Mi
Si
D
V
V
n
n
c
c
K ⋅==
6
• Šířka chromatografického píku
→ vycházíme z gaussovského píku
→ normální rozdělení
→ výběr dat odhad vlastností souboru
µ = odhad pro průměr či medián
σ = odhad směrodatné odchylky
→ určení intervalů v okolí průměrné hodnoty
→ šířka píku – délkové [mm, cm] či časové jednotky [s, min]
→ 4σ ……. šířka při základně (tečna v inflexních bodech)
2,354σ ……. šířka v ½ výšky píku
2σ ……. šířka mezi inflexními body
→ plocha píku
( )
2
;064,1 2/1
wh
AwhA
⋅
=⋅⋅=
7
• Aplikace kapalinové chromatografie
RPLC – různé sorbenty
HILIC
8
RP – HPLC = RPLC
• populární - přes 90 % aplikací v módu RPLC
• SF – nepolární charakter (např. C18, C8, C3, fenyl, atd.)
separace - různá volba nosiče SF a typu částic
• MF – voda (pufr) + organické rozpouštědlo (MeOH, MeCN, atd.)
modifikátory MF (např. tenzidy – IP RPLC)
• univerzální použití techniky – nepolární, polární, ionizované a iontové molekuly
• ionizované formy látky – menší afinita k SF ↔ potlačení ionizace v systému
• gradientová eluce – přídavek organické složky MF v čase→ ↑ eluční síly
• volba výchozích separačních podmínek podle vybrané SF
limitní faktory – obsah organické/vodné fáze
– koncentrace purfu (zabezpečí vzájemné mísitelnosti) → zasolení
– volba průtoku → vzniklý hydrodynamický odpor v systému
– volba teploty, pH → stabilita kolony, vzorku
• vysoké nároky na čistotu MF (min grad grade) a přípravu vzorku (filtrace přes 0,45-0,2 µm filtry)
9
• Princip separace u LLC (rozdělovací LC)
- využívá rozdílné rozpustnosti (tím i distribuce) molekul analytů mezi dvěma zcela
nemísitelnými kapalinami.
SF: mechanicky nanesená na inertním nosiči
: chemicky navázaná (polární, nepolární) na inetrním nosiči (tj. silkagel)
MF: a) NP – pentan, heptan, CHCl3 a jejich směsi
: b) RP – MeOH, MeCN, THF, IPA, voda a jejich směsi
• Počáteční podmínky v LLC – RPLC
MF: vodně-organická MF, pufr (citrátový, octanový, fosfátový, borátový) s ohledem na pKa
analytu.
SF: -C18 (ODS), -C8, fenyl-, kyano- – vhodné pro neutrální, neionizované analyty, rozpustné
v MF
Dosažené výsledky:
- rozlišení R > 1,5
- separační čas 5 – 10min
- kvantifikace do 5% (15%)
- symetrický pík (vs. interferenční píky), vysoká účinnost (úzký pík při základně, poměr S/N)
- minimální spotřeba rozpouštědla
- optimální tlak (drift základní linie)
10
Nosiče – silikagel, polymery, ZrO2
• Silkagel
- pracovní oblast pH 2-8 (<2 hydrolýza navázané fáze, >8 rozpouštění silikagenu)
- do T = 45 - 60 °C, pmax = 400 barů
- kyselý charakter → lepší zádrž pro bazické látky
- dnes tzv. endcapping, tj. zaslepování volných silanových skupin
- např. trialkylchlorsilanem – Zorbax Eclipse XDB C18 (Agilent)
Trimethylchlorsilan jako menší molekula než trioktadecylchlorsilan pokryje stéricky bráněné
volné silanolové skupiny.
11
- stérické stínění volných OH skupin – odstínění delším uhlíkatým řetězcem a zvýšení obsahu
vázaného uhlíku v nepolární fázi, zároveň i retence látek (↑ hydrofobicita SF).
- stabilita při nízkém pH (~ 1), MF obsahující TFA
- odolnost do T = 90 °C
Např. diisobutyl, diisopropyl – Zorbax StableBond C18 (Agilent)
- modifikace ligandu – začlenění polární skupiny do organického uhlíkového řetězce SF mezi
povrch silikagelu a ligandem.
- zmírnění interakce volných silanových skupin s bazickými polárními látkami
- ↑ polarita SF→ ↑ adsorpce vody v MF × hydrofóbnímu kolapsu (100% vodná fáze)
- pH a složení MF – přídavek organických aminů do MF a tím kompetetice s analytem o aktivní
centra zbytkových silanových skupin (jejich eliminace). Limitní podmínky viz SF bez zaslepení.
12
• Porézní polymery
- řešení separace bazických látek v alkalické oblasti.
např. polystyren, metylakrylát, akrylamid
- kompatibilní v celém rozsahu pH, hydrofóbní charakter
- stabilita limitovaná fčními skupinami polymeru
- chemická a mechanická stabilita
- limitní nižší tlaky, pmax = 200 barů
- obsahují mikropóry (~ 1nm) → zabraňuje přenosu hmoty zejména pro malé molekuly
- nižší účinnost → nevytlačily chemicky vázané nepolární SF!
• ZrO2
(ZirChrom kolona; obchodní zástupce Altech, Chromservis)
- extrémní stabilita - chemická a tepelná stabilita (T až do 200 °C) → HTLC (High temperature LC)
- prodloužená životnost kolony a snižuje se cena za analýzu
- pH stabilní 1-14, porézní i neporézní
- normální i reverzní mód (modifikace částic polybutadienem, polystyrenem, pyroliticky vyloučeným
uhlíkem, s nádlednou modifikací C18 ligandem)
- vs. alkylsilikagelová fáze v NP lepší selektivita ohledně separace stereoisomerů, látek lišících se
polaritou (steroly), v RP při separaci velmi polárních látek.
13
UPLC – ↓ průměr částic, ↑ specifický povrch a ↑ účinnost
– p ~ GPa
– při stejném průtoku jsou analýzy až 3x rychlejší než v klasickém analytickém uspořádání
(konkurence monolitům)
– BEH technologie (Ethylene Bridged Hybrid) - vysoká pH stabilita 1-12 (+ tříbodová vazba
ligandu na hybridní částici); brání hydrolýze silikagelu. Např. Acquity UPLC kolona,
X Bridge (Waters)
- stabilizace pH (pH 1- 12) zesítěním ethanovým můstkem, skupiny jsou začleněné do vrstev na
povrchu silikagelu při zachování čistého křemenného jádra. Zároveň i ↑ mechanická stabilita
silikagelových částic.
Např. technologie TWIN-NX, Gemini-NX kolona (Phenomenex)
14
Sorbenty
• totálně porézní mikročástice
- nejběžnější – kompromis mezi účinností, kapacitou, životností, tlakovou odolností, atd.
- zrnění 3 - 8 µm analytický systém, pórovitost ~ 60 % (5 µm)
• mikropelikulární částice
- tvrdé jádro, na povrchu tenký film (0,25 µm) → rychlá analýza, vysoká účinnost, malá kapacita
(pozor na dávkované množství), rychlý přenos hmoty
- zrnění 1,5 -2,5 µm
• perfúzní mikročástice
- objemné póry se síti menších pórů, vysoká rychlost MF, malé rozmytí píků
- aplikace u perfúzní chromatografie
15
• monolotický sorbent
- nejběžnější – kompromis mezi účinností, kapacitou, životností, tlakovou odolností, atd.
→ jednotlivé částice sorbentu (3 – 5 µm)
→ výborná separační účinnost (↓ velikost sorbentu stoupá zpětný tlak)
→ omezená max. rychlost průtoku MF
→ doba analýzy
→ pórovitost ~ 60 % (5 µm částic)
→ jediný kus pórovitého materiálu - makropóry (zrychlený přenos hmoty mezi SF a MF)
mesopóry (specifický povrch)
→ anorganické, polymerní
→ přednosti: doba analýzy
hydrodynamické vlastnosti
→ rychlý konvektivní tok MF bez přílišného zvýšení tlaku a bez ztráty separační účinnosti
→ pórovitost ~ 80 %
→ nevýhoda: reprodukovatelnost výroby (polymerizace přímo v koloně)
16
HILIC
• HILIC = Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography
• NPLC typ separace za RPLC podmínek
http://www.sequant.com/default.asp?ml=11625
• MF – voda, pufr (acetátový, mravenčnanový, hydrogenuhličitan), vysoká koncentrace vodoumísitelného
org. rozpouštědla (MeCN)
- gradientová eluce – eluční síla roste ↓ obsahu organické složky MF v čase
• SF – obojetný ion (sulfoalkylbetain), polyfunkční polymer (např. polymethylmetakrylát)
- hydrofilní (extrakce L-L) i elektrostatické interakce
- ↑ retence s hydrofilitou a s nábojem analytu (ionizované funkční skupiny)
http://www.hilic.com/
• limitní faktory – obs. organické MF cca 80% MeCN
– + malé množství těkavé vodné složky (>3 %)
– pufr 2-20mM, horní limit do 250 mM
– pH 2 – 10
– max. teplota 50 °C
– max. tlak p = 20 MPa
– ↓ průtok MF
17
HILIC
• dobrá retence pro polární látky
• symetrické tvary píků pro bazické látky
• snadno nahradí NPLC
• ortogonální selektivita k RPLC (2D-LC, matricové efekty)
• vhodná pro spojení s ESI, často vyšší citlivost (↑ obsah MeCN v MF)
• vliv rozpouštědla vzorku na tvar chromatografického píku
• vliv dávkovaného objemu na tvar píku
• pomalejší ustalování chromatografické rovnováhy
• komplexnější mechanismus separace (složitější predikce)
• hydrofóbní látky nejsou zadržovány
1. Amphetamine
2. Methamphetamine
3. Selegiline
18http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties
• použití techniky: makromolekulání analyty nevhodné pro eluci na RPLC, tj. cukry, metabolity,
kyseliny i báze, org. kyseliny, proteiny, peptidy, báze → nízká nebo záporná LogP hodnota
• LogP – logaritmus distribučního koeficientu látky v systému dvou nemísitelných kapalin,
voda/oktanol, popisuje polární vlastnosti molekuly
• vyšší hodnota LogP = vyšší hydrofobicita
• pro RPLC: LogP > 1
[ ]
[ ] 







=
vodanáneionizova
octanol
/
Analyt
Analyt
loglog vodaoctP
19
Chromatografické podmínky:
Kolona: ZIC-pHILIC, PEEK, 150×4,6 mm,
5µm
Injektováno: 5 µL
Průtok MF: 0,5 mL/min
MF (v/v): 80% MeCN
20% HN4)2CO3, 20 mM, pH 8,8
Detekce: 254 nm
Separace purinových a pirimidinových bazí:
Thymin (1), Uracil (2), Adenin (3), Cytosin (4), Guanosin (5)
20
Typy detektorů v kombinaci s LC
Volba – selektivita, citlivost, dynamický rozsah
1. UV-VIS (10-10 g/ml)
- Absorpční fotometrický detektor
- PDA/DAD – porovnání s knihovnou spekter
- aplikovatelný pro širokou škálu látek
- velký lineární dynamický rozsah
- možnost snadného změření spekter
2. MS = API techniky (10-13
g/ml)
- vysoká citlivost, selektivita a univerzálnost
- destruktivní technika
- cena, provozní náklady, nároky na čištění
- matriční efekty (rozdílnost odezvových faktorů)
3. Fluorimetrický (fluorescenční) detektor (10-9-10-12 g/ml)
(zdroj, monochromátor, čočka, měrná cela, fotonásobič, zesilovač, zapisovač)
4. Refraktometrický detektor (10-7 g/ml)
(zdroj světla, zrcadlo, měrná a referentní cela, fotonásobič, zesilovač, zapisovač)
5. Ampérometrický detektor (10-9 g/ml)
(pracovní, referentní, pomocná elektroda, zdroj napětí, zapisovač)
}
21
MS = hmotnostní spektrometrie
• fyzikální metoda – primárně (určení molekulové nebo atomové hmotnosti analytu)
sekundárně (identifikace sloučenin, objasnění struktury, kvantifikace)
• princip: molekuly analytu se ionizují v plynné fázi, následně jsou rozděleny buď v prostoru nebo
v čase podle jejich hmotnosti a náboje (m/z)
• ionizace – různé zdroje – polem, vysokoenergetickými částicemi (e-, foton, atom)
měkká vs. tvrdá ionizace
• hmotnostní analyzátor (separátor) – TOF, QqQ, IT
• detekce iontů – systém dynod – elektronový násobič, mikrokanálková destička
iontový zdroj iontový analyzátor iontový detektor
ionizace hmotnostní analýza (separace iontů) detekce iontů
vakuum
p ~ 10-8 Pa
22
Pojmy v MS
• jednotky
hlavní jednotka SI: kilogram kg
vedlejší jednotka SI: atomová hmotnostní jednotka u (a.m.u.)
(1/12 hmotnosti izotopu uhlíku o protonovém čísle Z=6 a nukleonovém čísle A=12. u=1,66057.10-27
kg)
jednotka: dalton Da
thomson Th (1Th = 1u/e = 1Da/e)
veličina: m/z
pozn: molekulová hmotnost M (hmotnost molekuly/prvku; -) vs. molární hmotnost MR (1 mol molekuly; g/mol)
• hmotnost iontů v MS (např. pro CO2)
nominální - vypočítaná z celočíselných hmotností prvků (12u + 2x 16u = 44u)
- použití pouze v nízkém hmotnostním rozsahu ↔ hmotnostní úbytek/nadbytek
monoizotopická - z přesných hmotností prvků (nejvíce zastoupené izotopy) (12,0000u + 2x 15,9949u = 43.9898u)
průměrná - vážený průměr hmotností jednotlivých izotopů podle jejich zastoupení (12,01 + 2x 16,00u = 44,01u)
• výpočet elementárního složení vs. přesnost!
• přesnost určení hmotnosti
vypocitana
vypocitanazmerena6
10)ppmv(
M
MM
m
−
⋅=∆
( )vypocitanazmerena
3
10)mmuv( MMm −⋅=∆
23
• výpočet a vliv přesnosti určení hmotnosti
G.Audi, A.H. Waspra, C. Tribault, Nucl. Phys. A, 729 (2003) 337-676
M([C29H35N2O]) = 427,2749
M([C29H35N2O]+•
) = 427.27435 (-1,29 ppm)
M([C29H35N2O+H]+
) = 428,2822
M([C29H35N2O]-•
) = 427,27545 (+1,29 ppm)
M([C29H35N2O-H])
= 426,2677
- hmotnost elektronu hraje významnou roli (0,5486 mmu)
• typy iontů:
[M±e]± molekulární ionty (přirozený náboj; po ztrátě nebo přijetí elektronu)
[M±H]±
kvazimolekulární ionty (disociace nebo asociace protonu)
[M±X]±
pseudomolekulární ionty (adukty, asociáty)
(disociace/asociace iontu; nekovalentní komplex s jinou složkou)
[(M-N)± …]± fragmentové ionty (štěpením kovalentní vazby analytu)
O N
+
N
CH3
CH3 CH3
Cl
-
24
• Hmotnostní spektrum – grafické zobrazení intenzity iontů na jejich poměru hmotnosti ku náboji
(m/z). Spektra jsou normalizována, y-osa (intenzita) je 0-100 %.
– profilové (kontinuální) – umožňuje odečíst šířku píku
– histogram (centroidní) – spektrum je převedeno na sloupcový graf, poloha signálu (m/z) je odečtena v
těžišti píku, intenzita odpovídá ploše nebo výšce píku
• Izotopy – atomy chemického prvku, které mají stejný počet protonů, ale rozdílný počet neutronů,
tedy stejné atomové číslo a rozdílnou atomovou hmotnost.
X (monoizotopické): 23Na, 127
I
prvky X+1: vodík (1H, 2H), uhlík (12C, 13C)
X+2: chlor (35Cl, 37Cl), kyslík (16O, 18O), stříbro (107Ag, 109Ag)
Izotopové složení víceatomového iontu je dáno kombinací izotopového složení atomů, které jej
tvoří.
731 732 733 734 735 736 737 738 739
%
0
100
734.4691
735.4691
736.4769
[M+H]+
izotopické příspěvky
kvazimolekulární ion
C13H4Br4O4Br
25
• rozlišení
i) FWHM – poměr hmotnosti iontu a šířky jeho píku v polovině výšky.
Používá se u analyzátorů, kde je konstantní šířka píku, tedy Q, IT, TOF.
ii) překryv píků – nejmenší rozdíl hmotností mezi stejně vysokými píky u nichž je výška překryvu
rovna definovanému zlomku výšky píku (př. 5%, 10% údolí).
Používá se u analyzátorů, kde je konstantní rozlišení pro celý hmotnostní rozsah, např.
sektorové přístroje.
• rozlišovací schopnost – schopnost přístroje (analyzátoru) oddělit sousední píky
i) ii)
m
m
R
∆
=
)( 21
1
2,1
mm
m
R
−
=
26
Kalibrace hmotnostní škály – pro získání správných výsledků.
– pomocí změření spektra kalibrační směsi a následnou korelací
změřených a vypočítaných (a správných) hodnot m/z
(před měřením se provádí kalibrace hmotnostní stupnice pomocí kalibračních standardů → chyba
naměřené m/z a skutečné m/z závisí na rozlišovací schopnosti resp. typu spektrometru a kvalitě kalibrace)
• Typy kalibrací
Kalibrace externí – kalibrace probíhá před měřením samotné analyzované látky, tedy
odděleně.
Kalibrace interní – kalibraci provádíme ze spektra, které obsahuje jak analyzovanou látku,
tak píky kalibrační látky. Kalibrace probíhá současně a poskytuje přesnější výsledky.
Kotvící hmotnost (Lock mass) – druh interní kalibrace. Cela hmotnostní škála se posunuje
podle jednoho kalibračního bodu. Slouží k malým úpravám škály m/z a vyžaduje předem
nakalibrovaný přístroj. Tento kalibrant může být dávkován do iontového zdroje, příp. se
může využít nějakého iontu z pozadí.
• Požadavky na kalibrační látky (např. perfluorované látky)
- bez paměťového efektu!, čisté, dostupné, netoxické sloučeniny
- pokrytí celého kalibrovaného rozsahu
- intenzivní píky s jednoduchými izotopovými klastry
!
27
MS vs MSn
• MS spektrum
- ionty vzniklé ionizací analytu (neutrální molekula) a případnou fragmentací kvazimolekulárního
(pseudomolekulárního) iontu.
• MS/MS (MS2) spektrum
- ionty vzniklé fragmentací iontu prekurzoru.
• tandemová MS, MSn
- sériové zařazení několika hmotnostních analytátorů
- 1. analyzátor – separace iontů podle m/z
selekce iontů o určitém m/z
- kolizní cela – sekundární ionizace/fragmentace
- 2. analyzátor – rozdělení fragmentů
- detekce iontů fragmentů
- v prostoru (více analyzátorů) či čase (jeden analyzátor)
- použití: objasnění struktury, specifická detekce
Iontový zdroj Analyzátor 1 Analyzátor 2Kolizní cela
QqQ
28
API techniky
• spojení HPLC s hmotnostním spektrometrem - spolehlivá, rutinní metoda
• technicky složitější interface – kapalná MF se sprejuje do části iontového zdroje, která je při
atmosférickém tlaku (tzv. API zdroje).
Vakuový systém v další části odstraní přebytečný plyn vytvořený sprejováním kapalné MF.
• API techniky – ESI, APCI, APPI, TSP, PB, EI, moving belt, …
V prostoru analyzátoru je vakuum (až 10-10
torr, tj. 10-8
Pa).
MS analyzátory a detektory mohou pracovat jen s nabitými částicemi (ionty).
29
Interpretace API spekter
• Určení MR
- ověření správnosti podle charakteristických aduktů (zásadní význam, aduktové ionty se
většinou nevyskytují u fragmentů), nejintenzivnější většinou [M+Na]+
(méně často adukty s MF, [M+H+CH3OH]+
; někdy i dimery typu [2M+H]+
, [2M+Na]+
)
- záporné ionty [M-H]-, dle složení MF můžeme očekávat např. [M+Cl]-, [M+CH3COO]-
typ, relativní intenzita pseudomolekulárních iontů závisí na složení MF, obsahu solí
• Dusíkaté pravidlo
Platí pro běžné organické prvky (C, H, N, O, Si, S, P, F, Cl, Br, I)
• M+2 prvky
- určení počtu Cl, Br, odhad přítomnosti Si, S
• MS/MS spektra
• sumarizace všech získaných informací
• ověření souladu retenčního chování s návrhem struktury
• potvrzení s komerčním/syntetizovaným standardem
EE+OE+.Lichý (1, 3, 5, …)
OE+.EE+Sudý (0, 2, 4,…..)
m/z sudám/z licháPočet dusíků
EE+ …sudý počet eOE+.
…lichý počet e-
30
ESI
• velmi „měkká“ ionizační technika (biomolekuly)
• tvorba vícenásobných iontů, aduktů
• princip: Taylorův kužel → emise kapek v kuželi → ↑ hustoty povrchového napětí kapek
a ↓ velikosti kapek (µm → nm) → vznik iontů v plynné fázi → jejich transfer do MS
( )
( ) )1/()(/
/)(/
1 +=
=
+ nmzm
nmzm
n
nKe zjištění m stačí pouze 2 sousední píky:
31
• složení eluentu dle podmínek pro LC separaci (složení, typ eluce)
• koncentrace analytu přicházející do iontového zdroje je určena dávkovaným množstvím na LC
kolonu a rozmytím při průchodu kolonou (~ 20-30 naředění)
• volba experimentálních podmínek:
- zásadité sloučeniny – detekce pozitivních iontů
– úprava pH (CH3COOH, HCOOH)
- kyselé sloučeniny – detekce negativních iontů
– úprava pH (NH3)
- neutrální sloučeniny – adukty s kationty, volba jiné techniky (SIMS)
• volba rozpouštědla:
- dostatečně rozpouští analyzované sloučeniny
- podporuje vznik iontů v roztoku
- snadno se zmlžuje, odpařuje a má nízkou solvatační energii
voda (~80%), metanol, etanol, isopropanol, butanol, acetonitril, aceton, tetrahydrofuran,
chloroform
• použití:
středně polární až iontové sloučeniny
32
APCI
• princip obdobný jako u CI
• vložené napětí na výbojovou jehlu (3-4kV) →
koronový výboj. Nejdříve ionizace molekul MF
(přebytek), následně jsou ion-molekulárními
reakcemi reakčního plynu (ionizované
molekuly MF) ionizovány molekuly analytu
i) Primární ionty vznikají ze zmlžujícího plynu
ii) Reakční ionty vznikají z MF a aditiv
iii) Hlavní mechanismy ionizace analytu
(protonace/deprotonace; výměna náboje; tvorba
aduktů; adice rozpouštědla; tvorba polymerních
klastrů)
• ionty jsou následně elektrodami usměrněny do
analyzátoru
• rozbití příp. nekovalentních klastrů
protiproudem sušícího plynu
33
• volba rozpouštědla:
- dostatečné rozpouštění analyzované sloučeniny
- snadno se zmlžuje, odpařuje a má nízkou solvatační energii
metanol, propanol, butanol, aceton, chloroform, toluen, alkany (n-hexan, cyklohexan), etanol,
isopropanol, voda, dichlormetan, benzen
• úprava pH:
kyselina octová, kys. mravenčí, mravenčnan amonný, octan amonný, čpavek, trietylamin,
tetraetylamonium hydroxid, tetrabutylamonium hydroxid
• pouze organické pufry!
Anorganické, např. fosfátový pufr:
• použití:
málo až středně polární sloučeniny,
do MR ~ 1500 Da,
větší tolerance obsahu solí v eluentu,
méně aduktových iontů
34
APPI
• technika podobná APCI
• kryptonová výbojka s energií fotonů 10 eV
- selektivní ionizace analytu a nikoliv MF –
energie je větší než IE nepolárních organických
molekul, ale menší než IE složek MF (MeOH,
MeCN, voda) nebo vzdušného kyslíku!
- vyšší citlivost použití
dopantu (toluen, aceton, IE < 10 eV), který
poté reaguje ion-molekulárními reakcemi s
analytem a nikoliv s MF
• mechanismus: ovlivněn řadou faktorů
• na rozdíl od ESI a APCI vznikají běžně ionty
s lichým počtem elektronů
• použití:
velmi nepolární látky nebo labilní látky
35
Vybrané hmotnostní analyzátory
• TOF • IT
• Q, QqQ
36
Rámcové porovnání hmotnostních analyzátorů
• citlivost jednotlivých technik
Třída Rozlišovací Přesnost Rozsah m/z Skenovací Lineární Cena
schopnost hmoty [.103
] rychlost dynamický
[.103] (ppm) [Hz] rozsah
Q 3 - 5 50 - 100 2 - 3 2 - 10 105
- 106
IT 4 - 20 50 - 100 4 - 6 2 - 10 104 - 105
TOF 10 - 60 1-3 10 - 40 10 - 50 104 - 105
Magnet 40 - 80 2 - 5 6 - 15 0.2 - 1 106 - 107
Oritrap 100 - 240 1 - 2 4 1 - 5 5.103
ICR 750 - 2500 0.5 - 1 4 - 10 0.5 - 2 104
37
Historie MS a spojení se separačními metodami
2. polovina 19. století – počátky MS
• 1953 – první hmotnostní spektrometr – V. Čermák, V. Hanuš, Č. Jech, J. Cabicar
• 1957 – první spojení GC/MS (Holmes, Morrell) – první komerční GC/MS v r.1967
• 1973 – první spojení HPLC/MS (Baldwin, McLafferty) – první komerční LC/MS v r. 1977
• 1987 – první spojení CZE/MS (Smith)
38
Převzato z přednášky P.Cvačky
1917 – základy elektrospreje – vzniku nabitých kapiček zmlžením kapaliny (Zeleny)
1953 – princip iontové pasti (Paul, Steinwedel)
1957 – první spojení GC/MS (Holmes, Morrell) – první komerční GC/MS v r.1967
1966 – chemická ionizace (Munson, Field)
1968 – elektrosprej jako zdroj iontů (Dole)
1973 – první spojení HPLC/MS (Baldwin, McLafferty) – prrvní komerční LC/MS v r. 1977
1974 – moving wire pro spojení HPLC/MS (Scott)
1976 – moving belt pro spojení HPLC/MS (McFadden)
1982 – ionizace APCI (Henion, Thomson, Dawson)
1983 – ionizace termosprejem (Blakley, Vestal)
1984 – Particle Beam pro spojení HPLC/MS (Willoughby, Browner)
1987 – první spojení CZE/MS (Smith)
1989 – elektrosprej biomolekul (Fenn)
1989 – MALDI (Hillenkamp, Karas, Tanaka)
39
HPLC vs. GC vs. CE
LC/MS
- pro většinu polárních i nepolárních látek
- většina aplikací
CE/MS
- pro velmi a středně polární látky
- omezené využití pro rutinní analýzy
CZE
GC/MS
- pro látky nízkomolekulární nepolární nebo
málo polární
- množství aplikací
Rozvoj separačních technik ve spojení s MS
40
Spojení separačních technik a hmotnostní spektrometrie
• v rámci jedné analýzy můžeme separovat a identifikovat komplexní směs
• MSn – strukturní informace
• kombinace výhod obou technik
• izolace látek na základě chromatografické separace a následné změření hmotnostních spekter
pro jednotlivé látky
• získané záznamy – UV chromatogram
TIC chromatogram
RIC/EIC chromatogram
MS spektra všech píků
Pumpa KolonaDávkovač
LC
RP, NPLC,
HILIC MS
API
(ESI, APCI)
iontový
zdroj analyzátor detektor
TOF, IT, Q
UV detektor
41
Režimy spojení pro přenos hmoty
• 3 režimy, předpoklad úspěchu:
- eliminace toku MF
- interface mezi metodami (API techniky)
• on-line (komerční spojení)
+ klasické komerční spojení
+ široce rozšířené (ESI, APCI,…)
– interface
– redukce průtokové rychlosti MF
• in-line (pohybující se pás, drát)
+ redukce tlaků
• off-line (nanášecí komora/zařízení, dělič toku, T-valve)
+ oddělení separace od MS
+ archivace vzorku
+ redukce tlaků
– snížení rozlišení separace při sběru
– časově náročnější; někdy nerealizovatelné (stopové koncentrace)
l
pR
t
V
η
π
8
4
∆
=
flow rate
pressure
difference
absolute viscosity capillary length
capillary radius
Kalkulace velikosti kapky
podle Poisseuille rovnice
pro laminární tok:
42
Stanovení priorit u LC analýzy
Druh analýzy – kvalitativní, kvantitativní, analytická, preparativní
1. Informace o vzorku (fyzikálně chemické parametry)
- počet sloučenin přítomných ve vzorku, strukturní a molekulární vzorec sloučeniny
- pKa sloučeniny
- jeho koncentrační rozsah, rozpustnost analytu (pevný vzorek)
- povaha matrice
2. Předúprava vzorku
- povaha matrice
- extrakce, zakoncentrování
- eliminace interferencí x ochrana kolony
3. Výběr vhodného způsobu detekce (selektivita, citlivost)
- první volbou je UV-VIS detekce, následně MS
4. Volba počátečních podmínek separace – volba LC módu, typu eluce
5. Optimalizace separačních podmínek – na základě dosažených výsledků
- tR, R, N, As, drift základní linie, tlak, interferenční píky, spotřeba rozpouštědla, atd.
6. Úprava separačních podmínek pro daný úkol
7. Validace metody (pro rutinní analýzu)
43
Volba chromatografického systému
vzorek → stopové kovy (IEC)
kovové cheláty (RPLC)
organická látka
velikost → MR vztažená k 2000 g/mol
rozpustnost
- voda → neelektrolyt (RP, NP, HILIC)
→ elektrolyt (IEX, IP)
- org. rozpouštědla
→ alkoholy (RP, HILIC, NP)
→ uhlovodíky (RP, NP)
strukturní rozdíly – nepolár. části
molekuly, fčí skupiny
Jakou separační techniku vybrat pro kterou látku?
Zdroj: Agilent technologies
44
Parametry ovlivňující LC separaci
• teplota – vliv na viskozitu a difúzní koeficient (↑T = ↑ účinnost)
- vyšší teplota pro urychlení analýz
- někdy lepší nižší teplota, degradace vzorku
- někdy omezení ze strany SF
• typ sorbentu – vliv retenci solutů a jejich selektivitu
• průtok MF – vliv na účinnost separace
• složení MF – vliv na selektivitu a rozlišení
- složení rozpouštědel, lineár vs. gradient (změna v čase)
- přídavek aditiv, pH
• parametry kolony
- průměr → kapacita roste se čtvercem průměru kolony
- délka → s ↑ délkou se ↑ účinnost (počet teoretických pater), tlak a doba analýzy
- velikost částic → snižováním jejich rozměru roste účinnost (specifický povrch), ale i
pracovní tlak
45
LC parametry (ne)ovlivňující MS spektra
• teplota separace – bez vlivu
• typ sorbentu – kvalitní kolona nesmí ovlivňovat MS spektra
• průtok MF – není přímý vliv na kvalitu signálu, nutné však změnit průtoky plynů
• složení MF – výrazný a zásadní vliv na kvalitu spekter
- složení rozpouštědel, gradient → ovlivnění ionizační účinnosti (intenzity signálu)
- přídavek aditiv → potlačení signálu, někdy naopak (neutrální látky, ESI)
• parametry kolony – má vliv na hodnotu průtoku MF, tím volba sušícího a zmlžujícího plynu.
ESI spektrum myoglobinu (16955 Da)
46
Obecné zásady LC/MS analýzy
• složení MF – volba rozpouštědla, aditiva (dostatečná těkavost, nekontaminují zdroj)
- chlorovaná rozpouštědla - ↑ kontaminace zdroje a horší stabilita signálu
- těkavá aditiva – HCOOH (0,1%, 2mM u MeCN), CH3COOH (0,2%), amoniak (0,05-1%)
- pufry 5-10 mM (HCOONH4, CH3COONH4)
- POZOR ion-párová činidla (tetraalkylamonné soli, sulfonové kyseliny) – silná až
nevratná kontaminace!
RPLC – MeOH, MeCN, lze i EtOH, 2-propanol (většinou nejlepší odezva při corg.roz~70-90 %)
- ↑ až 100% obsah vody → nutné ↑ F, teplotu sušícího a zmlžujícího plynu (nižší citlivost)
- 100% MeCN při APCI vyžaduje častější čištění výbojové eldy (tvorba grafického uhlíku
na eldě)
- plně kompatibilní s MS – API techniky v závislosti na polaritě analytu a složení MF
NPLC – lepší kompatibilita s APCI něž-li s ESI
- nutný obsah proton-donorního rozpouštědla (>5%), např. 2-propanol (100% hexan bez
signálu)
- kompatibilní s MS – většinou APCI, APPI; ESI nevhodný pro nepolární rozpouštědla
HILIC – viz RPLC
- kompatibilní s MS – API, ESI
47
• příprava MF
- rozpouštědla nejvyšší kvality (LC/MS)
- zabezpečit vzájemnou mísitelnost
- filtrace a odplynění MF !
• příprava vzorku
- filtrace před analýzou (0,22 µm porozita, PTFE, PVDF, nylon)
- dávkovaný objem dle kapacity kolony × zhoršení separace
- oplach dávkovacího zařízení × kontaminaci
• kolona
- dostatečná ekvilibrace (10-20x VM)
- skladování – vymytí aditiv (pufry, kyseliny)!, uchování ve směsi vody (↓) a rozpouštědla
- čištění dle řady protokolů – směs vody (↑) a rozpouštědla - IPA/THF - směs vody (↓) a
rozpouštědla
- předkolony (prodloužení životnosti), in-line filtry (mechanické nečistoty z MF)
- minimalizace mrtvého objemu → co nejkratší a nejužší kolony
spojky s min. mrtvým objemem
- termostatování kolony
objem (ml) průměr filtru
<1 4
<5 13
<100 25
48
Volba MS systému
biopolymery, vysokomolekulární
polymery, organokovy
iontové organické sloučeniny
organické sloučeniny
(neiontové)
nepolární
látky
• záznam kladných iontů – univerzální (většina sloučenin)
• záznam záporných iontů – organokovy, halogenované sloučeniny, sloučeniny obs. karboxy,
sulfo, nitro skupiny, atd.
• polarita molekul
49
• složení MF
- NP – nepolární rozpouštědla, vhodné APCI, APPI
- RP – techniky ESI, APCI, APPI
• průtok MF
- až 1 ml/min - APCI, APPI
- < 0,5 ml/min (podle obsahu vody) – ESI
- dle průtoku a složení MF je nutné upravit průtoky
sušících a zmlžujících plynů
• geometrie iontového zdroje → vliv na odezvu signálu
odolnost × kontaminaci
(b) vychýlení mimo osu, (c) pod úhlem 45°, (d) ortogonální sprej, (e) Z(M,..)-sprej
• hmotnostní analyzátory
- MS/MS, MSn – strukturní analýza, rozlišení izobarických sloučenin
- MS skeny – jednodušší spektra, kvantitativní analýza
• podle požadavků na analýzu – rozlišení a přesnost určení hmoty
(a) (b)
(c) (d)
(e)
50
Optimalizace LC/MS metody
• požadavky na LC/MS → separace cílových látek
→ usnadnění identifikace a kvantifikace (rozlišení jednotlivých látek; ion
suppression; ↑ citlivosti analýzy; identifikace stopových látek)
→ LC podmínky co nejméně ovlivňovat kvalitu signálu v MS
• způsoby optimalizace – metoda pokus a omyl
matematické modely a statistické postupy
LC cíl? → separace látek pro kvalitativní a kvantitativní analýzu
→ eliminace vlivu LC na MS signál
→ max citlivost a co nejnižší LOD
nástroj? → SF; MF; teplota separace
→ rozměry kolony, příp. jejich kombinace; velikost a typ sorbentu; průtok
kvalita (závisle proměnné)? → kapacita systému, selektivita, účinnost, rozlišení
• obecný postup
- výběr podmínek na základě odlišností mezi separovanými látkami (polarita, funkční skupiny, …)
- výběr kolony – sorbent, rozměry (začínat s kratší kolonou)
- volba MF, přídatných aditiv, volba pH (dle vlastností analytů)
- test navržených podmínek a jejich postupná optimalizace
!
51
Optimalizace RPLC – MS separace
• SF – C18 (C8, fenylová)
• MF – MeCN, MeOH, vodná složka
• pufry – pH 3 a 9
• Postup
1) analýza na C18 koloně při použití MF 100% MeCN
2) přídavek vodné složky do MF podle retence látek, příp. volba jiného separačního systému
3) vliv pH na separaci – hraniční hodnoty pH v kyselé a bazické oblasti
4) zopakovaní 1-3 kroků pro jinou MF a jinou kolonou/typ sorbentu
5) srovnání výsledků a výběr MF (složení, typ eluce), kolony (typ SF, průměr zrnění) a pH
6) na základě získaných výsledků provedeme případné další testy – kolona, MF, aditiv
7) optimalizace pro dosažení optimálních podmínek - ↑R, ↓ doba analýzy
52
Optimalizace NPLC – MS separace
• SF – Si (-NH2)
• MF – hexan, heptan/IPA, MeCN (bez zbytkové vlhkosti !)
• NPLC – horší reprodukovatelnost analýz a rozlišení
– APCI, APPI
• Postup
1) analýza při použití MF 100% hexanu s přídavkem IPA či MeCN
2) ↑ či ↓ modifikátoru podle retence látek, příp. přejít na HILIC systém v případě vysoké retence
polárnějšího rozpouštědla
3) test dalších kolon (-NH2)
4) optimalizace pro dosažení optimálních podmínek - ↑R, ↓ doba analýzy
53
Optimalizace HILIC – MS separace
• SF – HILIC
• MF – MeCN, voda > 3 %, aditiva
• HILIC – těkavější solventy – ↑ citlivost v MS v porovnání s RPLC
• Postup
1) analýza při použití MF s vyšším obsahem vody (kontrola retence látek)
2) úprava podmínek podle retence látek (obsah vody, aditiv)
3) na základě získaných výsledků provedeme případné další testy – kolona, MF (aditiv, pH)
4) optimalizace pro dosažení optimálních podmínek - ↑R, ↓ doba analýzy
Gradientová separace pantothenátu (2), Acetyl-CoA (3), AMP (4),
CoA (5), ADP (6), ATP (7) na ZIC-pHILIC PEEK koloně
150×2,1mm, 5µm.
MF (v/v): MeCN (A), 10mM (HN4)2CO3 + 0,2% NH4OH
Gradient: 0-15min 20-60% B, 15-20 min 60% B, ekvilibrace 15 min
20% B
54
Děkuji za pozornost