Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Plynová chromatografie C5060 Metody chemického výzkumu Jaromír Literák Ústav chemie PřF MU 7.12.2012 Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Plynová chromatografie Chromatografie je skupina separačních metod, jejichž společným znakem je rozdělování molekul složek směsi mezi stacionární a mobilní fázi. Dělení je založeno na rozdílné rychlosti pohybu jednotlivých látek s mobilní fází v důsledku odlišné distribuce látek mezi mobilní a stacionární fázi. Plynová chromatografie (GC – Gas Chromatography) je omezena tenzí par analyzovaných látek a jejich stabilitou za vyšších teplot (při teplotách do 400-450 ◦ C). Odhaduje se, že lze pomocí GC analyzovat 10–20 % všech známých látek. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Plynový chromatograf Nosný plyn = mobilní fáze; Split = dělič toku; GLC = gas-liquid chromatography; GSC = gas-solid chromatography nosny plyn regulátor prutoku split injektor kolona termostatovaná pec detektor o ´ V počátcích plynové chromatografy s náplňovými kolonami, v současnosti dominují kapilární kolony. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Plynový chromatograf První patentovaný plynový chromatograf sestrojil v Brně v roce 1952 prof. Jaroslav Janák (nar. 1924). Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Retenční charakteristiky látky Retenční čas tr – celkový čas, který analyt stráví v chromatografické koloně. Mrtvý čas kolony tm – tr látky, která není v koloně zadržována a pohybuje se stejnou rychlostí jako mobilní fáze. Redukovaný retenční čas tr tr = tm + tr Kapacitní poměr k ki = nstac nmob = tr tm kde nstac a nmob jsou rovnovážná látková množství látky ve stacionární a mobilní fázi. tok plynu tr = tm tr = tm + tr' tr > tr Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Retenční charakteristiky látky Kapacitní poměr k je přímo úměrný distribuční konstantě KD látky mezi danou stacionární a mobilní fází. KD = cstac cmob = nstac nmob × Vmob Vstac = k × Vmob Vstac kde nstac a nmob jsou rovnovážné koncentrace dané látky ve stacionární a mobilní fázi, Vstac a Vmob jsou objemy mobilní a staconární fáze. Separaci látek posuzujeme podle účinnosti vyjádřené jako počet teoretických pater N, rozlišení R a separačního faktoru α. Separační faktor α pro látky i a j: α = ki kj ki > kj Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Vyjádření účinnosti separace Rozlišení (R): R = 2 × tr2 − tr1 wb1 + wb2 = 1, 18 × tr2 − tr1 wh1 + wh2 kde tr – retenční čas píku wh – šířka píku v polovině jeho výšky (v jednotkách času) wb – šířka píku u základny (v jednotkách času) Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Vyjádření účinnosti separace Počet teoretických pater kolony (N): N = 5, 545 × tr wh 2 kde tr je retenční čas píku a wh – šířka píku v polovině jeho výšky (v jednotkách času). Počet teoretických pater je ovlivněn retencí látek, N je vyšší pro dříve eluující látky. Závisí také na teplotě. Pro výpočet N se užívají látky s k > 5. Výškový ekvivalent teoretického patra (H nebo také HETP): H = L N kde L – délka kolony N – počet teoretických pater Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Mechanismy rozšiřování zón analytu Hlavní mechanismy rozšiřování zón analytu na chromatografické koloně. a) Vířivá difúze b) Podélná molekulární difúze c) Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi d) Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona van Deemterova rovnice H = A + B u + C × u kde u zastupuje lineární rychlost pohybu mobilní fáze, konstanta A zastupuje vířivou difúzi, B podélnou difúzi a C odpor proti přenosu hmoty jak ve stacionární tak i mobilní fázi. V kapilárních kolonách je málo významná vířivá difúze → Golayova rovnice. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona van Deemterova rovnice Optimální rychlost průtoku mobilní fáze uopt odpovídá minimu na křivce van Deemterovy závoslosti a zaručuje maximální rozlišení. Praktická optimální rychlost průtoku mobilní fáze upract – kompromis mezi optimálním rozlišením a rychlostí analýzy. upract = 1, 5 − 2, 0 × uopt Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Plynový chromatograf – Inlet Nástřik se splitem / bez splitu Nástřik na kolonu Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Plynový chromatograf – Inlet Head Space analýza PTV – Programmed Temperature Vaporising SPME – Solid Phase Micro Extraction Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Plynový chromatograf – Split Nástřik bez splitu (splitless) – stopová analýza. Split aktivován určitou dobu po nástřiku. Nástřik se splitem – vhodné pro koncentrované vzorky. Splitovací poměr – poměr toku splitovacím ventilem a kolonou. Doporučené splitovací poměry: Vnitřní průměr Splitovací kolony / mm poměr 0,10 1:50–1:75 0,19–0,25 1:10–1:20 0,32 1:8–1:15 0,53 1:2–1:5 Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Vliv splitovacího poměru Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Plynový chromatograf – Inlet Objem nástřiku – Obvykle 1–3 µl, zplyněný vzorek by měl zaplnit max. 75 % objemu lineru (backflash problém!). Neexistuje příma úměra mezi nastřikovaným objemem a plochou píku. Teplota inletu – Dostatečná pro evaporaci vzorku, obvykle 200–300 ◦ C. Typ lineru – Podle způsobu nástřiku. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Nosný plyn Výrazný vliv má typ nosného plynu a jeho průtok. Nosný plyn Výhody Nevýhody Vodík Levný, účinné dělení Explozivní Dusík Levný Horší dělení látek Helium Účinné dělení, nehořlavý Drahý Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Teplotní program pece Podstatný faktor ovlivňující kvalitu rozdělení látek a délku analýzy. Teplotní gradient je užitečný při dělení látek výrazně se lišících těkavostí nebo silou specifických interakcí se stacionární fází. Separaci látek lze zlepšit zvýšením rozdílu v tr (změna teploty a KD) a také zúžením píků (změna rozměrů kolony, rychlost průtoku nosného plynu). Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Refokusování vzorku Technika užívaná ke zúžení šířky píků, obzvláště při splitless nástřiku a těkavých analytech. Počáteční teplota kolony je o 10 ◦ C nižší, než teplota varu rozpouštědla. Podobného efektu dosáhneme, pokud je počáteční teplota kolony min. o 150 ◦ C nižší, než teplota varu analytů. tok plynu film solventu tok plynu tok plynu tok plynu Analyt Solvent Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Stacionární fáze Kapilární GC kolony Vnitřní průměr / mm Označení 0,10 Minibore 0,19–0,25 Narrow 0,32 Wide 0,45 High speed megabore 0,53 Megabore Složení stacionární fáze Zesíťované (crosslinked) a vázané (bonded) stacionární fáze Low bleed columns Si R R O n Polysiloxany Si R R O Si n O R R Si R R Si R R O Siaryleny (low bleed "MS" columns) O C H H C H H O HH n Polyethylenglykol (PEG) m Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Povaha stacionární fáze Základní druhy interakce analytu se stacionární fází: Disperzní síly (van der Waalsovy síly) Interakce dipólů molekul Vodíkové vazby Si R R O n Polysiloxany R Druh interakce Dispezní Dipolární Vodíkové můstky Methyl Silné Žádné Žádné Fenyl Silné Slabé Slabé Kyanopropyl Silné Velmi silné Slabé Trifluormethyl Silné Dobré Slabé PEG Silné Silné Dobré S tloušťkou vrstvy stacionární fáze roste kapacita a účinnost dělení. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Povaha stacionární fáze Běžně se užívají nepolární stacionární fáze, u nichž převládají disperzní interakce – pořadí eluce látek odpovádá jejich těkavosti (tenzi par). Tyto fáze jsou také chemicky stabilnější. V případě obtížného dělení látek volíme mobilní fázi podle zásady similia similibus solvuntur. Chemické poškození stacionární fáze: Kyslík Silné anorganické kyseliny (HCl, HBr, H2SO4, HNO3), báze (NH3) a organické kyseliny (CF3COOH) Tepelné poškození stacionární fáze Poškozený řetězec polysiloxany může depolymerovat: ∆T Si CH3 CH3 O Si CH3 CH3 O Si CH3 CH3 O Si CH3 O H3C Si O Si HO CH3 CH3 CH3H3C Si CH3 CH3 O Si CH3 CH3 O Si CH3 CH3 OH + O Si O Si O Si CH3H3C CH3 CH3H3C H3C Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Povaha stacionární fáze GC v tomto uspořádání je příkladem rozdělovací chromatografie, každá látka je charakterizována distribuční konstantou mezi mobilní a stacionární fází KD. V případě, že KD nezávisí na koncentraci, je distribuční isoterma lineární a pík má ideální zvonovitý tvar. Nelineární isotermy: cMOB cSTAC cMOB cSTAC tr odezva detektoru tr odezva detektoru Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Úvod Inlet Nosný plyn Teplotní program Kolona Vliv délky a vnitřního průměru kolony Vliv vnitřního průměru kolony: Vnitrní prùmer kolony Úcinnost kolony Tlak na hlave kolony Kapacita kolony < < < Vliv délky kolony: Délka kolony Úcinnost kolony Tlak na hlave kolony Cena kolony < < Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace TCD FID ECD MS Teplotně vodivostní detektor Teplotně vodivostní detektor (TCD, katharometr) – Detektor obsahuje zahřívané odporové vlákno, které se ochlazuje protékajícím plynem, čímž se mění jeho elektrický odpor. V praxi se vedle sebe zapojují dva TCD detektory, do jedné z měrných cel se přivádí čistý nosný plyn, do druhé plyn vycházející z kolony. Realtivně málo citlivý typ detektoru. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace TCD FID ECD MS Plamenově ionizační detektor Plamenově ionizační detektor (FID) – Plyn z chromatografické kolony je zaváděn do kyslíko-vodíkového plamene, kde probíhají během hoření ionizační reakce vedoucí ke vzniku iontů, které se detekují na polarizovaných elektrodách. Proudové pozadí je mezi 10−13 a 10−14 A, zatímco proud generovaný po spálení analytů je v rozmezí 10−12 –10−6 A. FID poskytuje odezvu téměř na všechny organické látky, pro uhlovodíky je odezva úměrná počtu uhlíkových atomů v molekule. Odezvu nedává většina anorganických plynů a par a některé organické látky (formaldehyd, CCl4). Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace TCD FID ECD MS Detektor elektronového záchytu Detektor elektronového záchytu (ECD) – Selektivní detektor vysoce citlivý na elektronegativní atomy a skupiny, zejména na halogeny. Nosný plyn (dusík) je vlivem β záření v detektoru ionizován, čímž vzniká konstantní proud. Zdrojem β záření jsou 3 H nebo 63 Ni. Elektronegativní atomy v analytu zachycují pomalé elektrony, čímž dochází ke snížení ionizačního proudu. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace TCD FID ECD MS Hmotnostní detektor Jako detektor v plynové chromatografii může sloužit hmotnostní spektrometr (MS), který poskytuje vedle chromatogramu hmotnostní spektra analytů. Existuje několik typů MS, používají se také jejich kombinace (MS/MS). Hmotnost iontů vyjadřována jako m/z. Sektorový hmotnostní spektrometr TOF (Time of flight) Kvadrupólový hmotnostní spektrometr Iontová past Orbitrap Iontová cyklotronová resonance Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace TCD FID ECD MS Hmotnostní detektor Většina GC-MS technik využívá elektronovou ionizaci nebo chemickou ionizaci. Průtok mobilní fáze omezen požadavkem na vysoké vakuum v MS. př.: hmotnostní spektrometr s kvadrupólovým hmotnostním filtrem a elektronovou ionizací: Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace TCD FID ECD MS Hmotnostní detektor MS jako detektor může pracovat v režimu scanu – měří hmotnostní spektrum v zadaném rozmezí hmot, nebo jsou sledovány pouze vybrané ionty (SIM/SIR). Spektrometry s vysokým rozlišením umožňují stanovit sumární vzorec. Možnost MS/MS. př.: hmotnostní spektrometr s dvěma kvadrupólovými hmotnostními filtry: Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Kvalitativní Kvantitativní Kvalitativní analýza – retenční indexy Při kvalitativní analýze se identifikace analytu provádí na základě srovnání retenčních dat analytu a standardu. Za stejných experimentálních podmínek je charakteristikou látky její retenční čas tr , respektive retenční objem Vr , což je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se příslušný analyt dostal od počátku ke konci chromatografické kolony. Univerzálnější charakteristikou je kapacitní poměr dané látky. Retenční indexy (Kovátsovy indexy) Přepočet retenčního času (objemu) neznámé látky na index, jehož hodnota nezávisí na chromatografickém systému a lze jej tabelovat a srovnávat. Retenční chování vztahujeme na řadu n-alkanů: tr,vztr,n tr,n+1 tr,n+2 n-alkany vzorek tr odezva detektoru Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Kvalitativní Kvantitativní Kvalitativní analýza – retenční indexy Retenční index referenčních n-alkanů se vypočítá jako stonásobek počtu uhlíku v molekule daného n-alkanu; např. retenční index propanu je 300. Při isotermní analýze získáme retenční index látky nacházející se mezi dvěma nejbližšími homology n-alkanů o počtu atomů uhlíku n a (n+1): RI = 100 × n + 100 × log(tr,vz ) − log(tr,n) log(tr,n+1) − log(tr,n) kde tr jsou příslušné redukované retenční časy a n je počet atomů uhlíku v molekule lehčího n-alkanu. Při analýze s teplotním programem získáme retenční index vzorku z rovnice: RI = 100 × n + 100 × tr,vz − tr,n tr,n+1 − tr,n Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Kvalitativní Kvantitativní Fingerprinting Užitečné v případě, kdy nesledujeme určení identity neznámé látky, ale jde nám o určení identity a původu směsi látek. Typickým příkladem jsou směsi uhlovodíků ropného původu. Uplatní se metoda otisku palce, „fingerprint , kdy se srovnává profilové složení vzorku s referenčními směsmi, podle kterého se dá usoudit na původ vzorku. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Kvalitativní Kvantitativní Kvantitativní analýza Plocha pod píkem látky je přímo úměrná množství látky. Koeficient úměry (response factor) se liší pro různé látky. Metoda vnitřní normalizace. Metoda standardního přídavku – ke vzorku se přidává známé množství stanovované látky. Z plochy analytu ve vzorku s a bez přídavku lze vypočítat koncentraci. Absolutní kalibrace – pro přesnost je kritický objem nástřiku. Kalibrační přímka: Ai = ki × ci + b kde Ai je plocha signálu analytu i, ci je koncentrace analytu i, ki je response factor a b konstanta. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Kvalitativní Kvantitativní Kvantitativní analýza Metoda vnitřního standardu – ke vzorku se přidává známé množství vnitřního standardu. Kalibrační přímka: Ai Aistd = ki × ci cistd + b kde Ai je plocha signálu analytu i, Aistd je plocha signálu vnitřního standardu, ci je koncentrace analytu i, cistd je koncentrace vnitřního standardu, ki je response factor a b konstanta. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Kvalitativní Kvantitativní Separace enantiomerů Stacionární fáze modifikovaná chirálními látkami (deriváty cyklodextrinů). Důležitá je entropická stránka interakce mezi analytem a stacionární fází → nejlépe isotermní separace, optimalizace teploty. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Inverzní chromatografie Obvykle varianta GSC – adsorpční chromatigrafie. Podobné instrumentální provedení jako analytická GC, cílem však není rozdělit směs látek, ale na základě retenčních charakteristik známé látky vnesené do proudu nosného plynu charakterizovat povrch stacionární fáze. Detektorem TCD, FID, ECD, MS. Charakterizace povrchů materiálů, charakterizace polymorfů krystalických látek. Identifikace kyselých, bazických nebo polárních skupin na povrchu. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Dvoudimenzionální GC Současné kapilární kolony mají okolo 100.000 teoretických pater a jsou blízko hranic svých možností. Dvoudimenzionální GC – obracení průtoku mobilní fáze nebo využití dvou kolon. Zvýšení kapacity – počtu látek ve směsi, které chromatograf je schopen rozdělit. Teoreticky je celková kapacita součinem kapacit v jedné a druhé dimenzi. Potřeba separace složitých směsí (přírodní látky, environmentální vzorky, petrochemické produkty). Možnost výrazně zlepšit separaci látek s využitím dvou běžných chromatografických kolon s odlišnými fázemi. Heartcutting (cut and transfer) Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Dvoudimenzionální GC Comprehensive 2D GC – každý z píků v jedné dimenzi je přenesen samostatně na druhou kolonu. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Derivatizace Derivatizace – úprava vlastností látek tak, aby je bylo možné stanovit pomocí GC. Problematické jsou: Nízká volatilita sloučenin (skupiny –OH, –NH–, –SH, –COOH). Vysoká volatilita. Deformovaný tvar píku, špatná separace látek, nízká citlivost detektoru. Adsorpce látek na aktivních površích uvnitř chromatografu. Nízká tepelná stabilita. tr odezva detektoru Někdy je potřeba také deaktivovat povrchy uvnitř chromatografu, např. liner a skleněnou vatu v lineru. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Derivatizace Silylace – zavedení –SiR3 skupiny na nukleofilní atomy. R1 OH TMSC báze R1 O Si CH3 CH3 CH3 Silylační činidla jsou citlivá na vlhkost. Příklad silylačních činidel: Cl Si CH3 CH3 CH3 N H SiSi H3C CH3 CH3 CH3CH3 H3C HMDSA TMSC R O N Si Si CH3 CH3 CH3 H3C H3C CH3 BSA N N Si CH3 CH3 H3C TMSI Zbytky silylačních činidel mohou poškodit některé typy stacionárních fází (PEG). Vzorek také může obsahovat R3Si–O–SiR3 (produkt hydrolýzy silylačního činidla). Silylace Si–OH skupin na povrchy skla – jeho deaktivace. Jaromír Literák Plynová chromatografie Úvod GC Detektory Analýza Inv. chromatografie 2D-GC Derivatizace Derivatizace Acylace – zavedení –C(O)R skupiny na nukleofilní atomy. Produkty acylace jsou obvykle odojnější vůči hydrolýze než produkty silylace. Deriváty obsahující zbytek halogenované kyseliny zvyšují citlivost ECD detektoru. Reakce s anhydridy nebo halogenidy kyselin – reakcí vzniká kyselina, kterou je potřeba před stanovením odstranit. R X O + R1OH R O O R1 + HX Alkylace – zavedení alkylové skupiny na nukleofilní atomy, nejčastěji methylace. Methylační činidla: N CH3 CH3 H CH3O CH3O CH3OH + BF3 CH2=N2 Jaromír Literák Plynová chromatografie