Metody studia bílkovin



Studium struktury         – molekulární vlastnosti

                                   - funkce – (katalytické aj. vlastnosti)


Podle potřeby a účelu – isolace x studium in situ


-         Isolace – metody více či méně komplikované podle účelu (čisté nativní bílkoviny pro
studium vlastností event. farmakologii, hrubé isolace pro průmysl apod.)





Isolační postupy – separační metody:


Isolace pomocí metod více či méně komplikovaných podle účelu (čisté nativní bílkoviny pro studium
vlastností event. farmakologii, hrubé isolace pro průmysl apod.)


Obecné kroky při isolaci bílkovin


-desintegrace materiálu

-preparativní centrifugace

-srážecí metody, jsou založeny na změně rozpustnosti

- membránové separace,

- chromatografie,

- (preparativní elektromigrační metody – elektroforéza),

- krystalisace.


Analytické postupy – včetně metod separačních:


Elektroforéza a chromatografie v analytickém měřítku,

- spektrální metody,

- chiroptické metody,

- rentgenostrukturní analýza,

- NMR,

- MS

- další speciální metody
















Určení primární struktury


Analýza aminokyselinového složení.


Bílkovina se hydrolyzuje totálně (silně kyselé či zásadité prostředí, zatavená ampule, autokláv).
Směs aminokyselin se analyzuje standartními metodami, klasicky iontoměničovou chromatografií
(analytické provedení), nověji se užívá hydrofobní chromatografie nebo kapilární zonová
elektroforéza.


Obsah aminokyselin se zjišťuje vhodnou metodou, nejčastěji reakcí s činidlem poskytujícím barevný
produkt. Aminokyseliny poskytují řadu specifických reakcí v závislosti na bočním substituentu (viz
laboratorní cvičení), které nejsou vhodné pro tuto analýzu. Vhodnou reakcí je taková, kterou
poskytují všechny aminokyseliny – tuto podmínku téměř splňuje reakce ninhydrinová. Činidlo (roztok
ninhydrinu) poskytuje modrofialové zbarvení se všemi aminokyselinami s výjimkou Pro (a Hypro), kdy
vzniká žluté zbarvení.















Schéma ninhydrinové reakce obecně, λ = 570 nm





Ninhydrinová reakce s prolinem, λ = 440 nm





Iontoměničová chromatografie aminokyselin





Hydrofobní chromatografie aminokyselin



Další způsoby derivatizace




Určení pořadí aminokyselin - sekvenace



Sangerova metoda





Edmanovo odbourání



















Schéma sekvenátoru





























Syntéza polypeptidů



Ačkoli se postupně rozvinula řada efektivních molekulárně biologických metod přípravy bílkovin,
z nichž mnohé jsou průmyslově využívány (insulin), příprava chemickou syntézou má stále
opodstatnění. Vychází z obvyklých syntetických postupů, kdy reagují aminokyseliny s aktivovanými
skupinami, které mají vytvořit peptidovou vazbu, naopak se chrání skupiny, které spolu reagovat
nemají. Hlavním problémem bylo čištění meziproduktů, které v roztoku vede ke značným ztrátám a tím
znemožní syntézu delších řetězců.










































MERRIFIELD