Imobilizace enzymů • enzymy - průmyslové použití - biokatalytické konverse - bioanalytické aplikace, enzymové sensory • ekonomický aspekt - snížení výrobních nákladů enzymových procesů díky opakovanému použití • dlouhodobá stabilizace enzymové aktivity • snadná separace výsledného produktu - dvoufázový systém, enzym zachycen na heterogenní fázi - substrát, produkt volně v roztoku - realizace kontinuálně pracujících procesů (enzymové reaktory) • nevhodné, pokud je i enzymový substrát nerozpustný Ideální nosič enzymu • levný, inertní, mechanicky pevný, chemicky stabilní • zachovává nebo zvyšuje specifitu enzymu (dána poměrem kcJKm) • snižuje inhibici enzymu produktem • posunuje pH optimum enzymu žádaným směrem • zabraňuje mikrobiální kontaminaci • omezuje nespecifickou adsorpci 1 Způsoby imobilizace > a adsorbce > b kovalentní vazba ► c zachycení v polymeru, "entrapment" ► d zachycení v membránovém váčku, "cofinement" Volba nosiče ' nízká cena (po zničení enzymové aktivity se vyhodí) ' drahé nosiče - při malém rozsahu procesu, případně pokud je lze použít opakovaně (opakovaná imobilizace enzymu) ' uplatní se forma, tvar, mech. stabilita, hustota, porosita, distribuce velikosti pórů, povrchový náboj (posun pH optima reakce), hustota reaktivních skupin (vazebná kapacita) ' speciální vlastnosti - magnetismus - rozklad nežádoucích produktů (Mn02 a peroxid vodíku) - povrch s redukčními vlastnostmi (Ti02) Geometrické uspořádání • částice („beads") - definovaná velikost a porosita • filmové povlaky - tenké vrstvy na vhodném neutrálním nosném materiálu • membrány - současně je možné realizovat biokatalytickou reakci a separaci na základě rozdílné velikosti substrátu a produktu • vláknité materiály - vysoký podíl povrchu - velká objemová aktivita • pěny - zachycení uvnitř (polyurethany) Struktura - mikroporesní 0.1 až 10 nm - mesoporesní 3 až 10 nm - srovnatelné se velikostí enzymů - makroporesní 8 až 1000 nm, povrch 25 až 100 m2/g - neporesní - výborná průtočnost, ale malá kapacita a malý povrch - gelovitá - nemá stálé póry, ty vznikají až při nabobtnání; obdoba neporesního uspořádání Adsorpce enzymů na nosič • jednoduchý, široce použitelný postup - velmi mírné podmínky, zachování aktivity - není kovalentní vazba, není narušení konformace • reversibilita - jak enzymu (purifikace), tak vlastní matrice - obojí lze regenerovat a použít znovu • možnost vysokých obsahů (až 1 g enzymu na 1 g nosiče) • ale slabá interakce - enzymy se mohou postupně spontánně uvolňovat z matrice • zúčastněné interakce - nespecifické (van der Waalsovy síly, vodíkové můstky, hydrofilní interakce): CPG, silikagely - biospecifické - přes ligand interagující s enzymem (mimo aktivní místo) - interakce s imobilizovanými barvivy nebo ionty kovů - iontové interakce (ionexy) - hydrofobní interakce: PET, HDPE, polyethylentereftalát, latex (polystyren), poly(ST-DVB), amberlit XAD, silikáty, zeolity, talek • částečná desolvatace v průběhu vazby na nosič, může docházet ke změnám konformace - stabilizace, změny aktivity a specifity katalyzované reakce Iontové interakce • syntetické pryskyřice (SP) - kopolymery akrylamidu a kys. maleinové nebo itakonové, fenolformaldehydové kondenzáty • SP s povrchovými skupinami - Dowex, Amberlit, Duolit • polysacharidové deriváty - DEAE-celulosa, DEAE-dextran, DEAE-Sephadex, CM-celulosa, CH-Sepharosa, AH-Sepharosa, Q-Sepharosa, S-Sepharosa - DEAE ... diethylaminoethyl, CM ... -0-CH2-COOH, CH ... -NH(CH2)COOH, AH ... NH-(CH2)6-NH2, Q ... -CH2-N+(CH3)3, S ... -CH2-S03H - všeobecně velmi hydrofilní materiály, náboj závisí na pH okolního roztoku • důležitou roli hrají podmínky, zejména pH, při adsorpci Invertasa Typ nosiče % vazby DEAE-Sephadex (anex) CM-Sephadex (katex) pH 2.5 0 100 pH 4.7 100 75 pH 7.0 100 34 Kovalentní imobilizace enzymů • poresní / neporesní nosiče, vzájemná velikost pórů a molekul enzymu • povrchová hustota navázaných molekul • reaktivní skupiny dostupné na speciálních nosičích K hr ^ W * a anhydrid, b karbonát, c aldehyd, d epoxid, e azid, f isothiokyanát, g nitrofenylester karboxylové kyseliny, h azlakton • typické množství 0.02 g enzymu na 1 g nosiče Silikagel • "silica", Si02 x H20, voda chemicky vázaná v nestechiometrickém poměru, obsahuje vazby - siloxanové (Si-O-Si) - silanolové (Si-OH) - aktivují se silanizací • amorfní struktura, výborná mechanická stabilita - vysoké tlaky • omezená pH stabilita (mezi 2 a 8), náchylný na nespecifické interakce • Porézní sklo CPG, "controlled pore glass" • výborné mechanické vlastnosti - pro techniky pracující s vysokými tlaky - poměrně křehké, při aktivacích raději jemně třepat a nemíchat - při výměně roztoků je dobré používat vakuum, aby se odstranily bublinky zachycené v pórech • příprava - borosilikátové sklo se zahřeje - dojde k separaci borátové a silikátové fáze, boráty se odstraní vylouhováním, vzniknou uniformní póry - v alkalické oblasti nad pH 8 se rychle degraduje • nízká nespecifická adsorpce Vlastnosti CPG Silanizace aktivace inertních povrchů pokrytých vrstvou oxidu (sklo, silikáty, slída, oxidy kovů) - v hydratovaném stavu obsahuje hydroxylové skupiny, např. Si-OH, silanolový zbytek reakcí se silany vzniká spontánně uspořádaná vrstva - obvykle několik vrstev, ne monovrstva - nepoužívají se organické halogenované silany (jsou příliš reaktivní a žádná další skupina už by nezbyla), ale méně reaktivn a Ikoxy deriváty silanizací se na povrch modifikovaného nosiče zavedou vhodné reaktivní skupiny X OR 1 | RO—Si-X O | |-OH , 1 V OR |—O—Si—X | — -V . 1 ľ 1-OH I—o—Si-X 1 ROH ' 1 o 5 Silanizační činidla • aminosilany _ APTES |(CH3CH2Q)3Si—(CH2)3-NH. (3-aminopropyl)-triethoxysilan APDEMS (3-aminopropyl)-diethoxy-methylsilan APMES (3-aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilan, monofunkční - vede ke vzniku monovrstvy OCH,CH, I 2 3 H3C—Si—(CH2)3-NH. OCH,CH, CH, I 3 CH3CH20—Si—(CH2)3-NH. CH, glycidoxysilany - GOPS glycidoxypropyl-trimethoxysilan - GPMES (3-glycidoxypropyl)-dimethyl-ethoxysilan merkaptosilany - MPTS (3-merkaptopropyl)-trimethoxysilan - MPDMS H (CH30)3Si—C-C H, \/ O -CH. CH, I 3 H CH,CH,0—Si-C-C-CH, CH3H* \/ 3 O (CH3Q)3Si-(CH2)3-SH (3-merkaptopropyl)-methyl-dimethoxysilan OCH,CH, I 2 3 H3C—Si—(CH2)3-SH ochxh, Agarosa (Sepharosa) CH,OH OH polysacharid tvořen z D-galaktosy a 3-anhydrogalaktosy poly-{P-1,3-D-galaktosa-a-1,4-(3,6-anhydro)--L-galaktosa} sekundární a primární struktura je komplexní, vláknitá s přítomnými póry přirozená je mechanicky labilní (zahřátím nad 40 °C se rozpouští) - modifikuje se zesíťováním pomocí epichlorhydrinu nebo divinylsulfonu - ztratí se tím část využitelných hydroxylových skupin - zesítěná je relativně stabilní (rozpouštědla mísitelná s vodou, pH 3 až 14), - neměla by se nechat vyschnout 6 Sepharosa • nejběžnější je Sepharosa CL-6B - zavedená firmou Pharmacia (Amersham Biosciences, dnes GE Healthcare) - CL = „crosslinked", 6B = 6% „beaded" agarose - póry dostatečné pro biomolekuly do 1 MDa, varianty 2B a 4B do 10 MDa - nosič dodávají i firmy BioRad jako Bio-Gel A a IBF jako Ultrogel • pro aktivaci vhodné metody zaměřené na hydroxylové skupiny Sepharose Forma (částice vesměs 90 |jm) High Performance 6% highly cross-linked agarose (34 urn) 6 Fast Flow 6% highly cross-linked agarose 4 Fast Flow 4% highly cross-linked agarose CL-6B 6% cross-linked agarose CL-4B 4% cross-linked agarose 6B 6% agarose 4B 4% agarose Preaktivované Sepharosy NHS-activated Sepharose High Performance 12-atom. hydrofil. můstek, přes -NH2 NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow viz výše CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow vazba primárních -NH2 skupin EAH Sepharose 4B 10-atom. můstek, přes -NH2 ECH Sepharose 4B 9-atom. můstek, přes -COOH Epoxy-activated Sepharose 6B 12-atom. hydrofil. můstek, přes -OH, -NH2 nebo -SH skupiny Activated Thiol Sepharose 4B 10-atom. můstek pro reversibilní vazbu přes volné thioskupiny Thiopropyl Sepharose 6B 4-atom. hydrofilní pro reversibilní vazbu proteinů a thiolovaných ligandů. Reaguje i s těžkými kovy, alkyl- a arylhalogenidy a dává adiční reakce s C=0, C=C a N=N vazbami Aktivace -OH v sacharidových matricích • epoxyskupiny (bisoxiran, epichlorhydrin) • bromkyanová metoda • divinylsulfon ch =ch-so,-ch=ch„ r-nh, (r-oh, r-sh) |-oh |-0-ch2-ch2-S02-ch=ch |-0-ch2-ch2-S02-ch2-ch2-nh-r sultonylchloridy - tosylchlorid = p-toluensulfonylchlorid - tresylchlorid = 2,2,2-trifluorethansulfonylchlorid ci-so,—^j)-ch3 tosylchlorid ci-so2-ch2cf3 tresylchlorid r-nh2 ho-so2-ch2cf3 I-oh I-0-S02-ch2cf3 I-nh-r Dextranové nosiče • materiály Sephadex, Superdex • glukosové jednotky spojené 1,6 vazbou, větvení i přes 1,2 /1,3 a 1,4 spoje • mechanicky málo stabilní • náchylné na bakteriální degradaci • glykosidické vazby nestabilní při nízkém pH 8 Celulosa použití není tak běžné, spíše v průmyslové oblasti velmi často se objevuje ve formě membrán lineární polymer z 1,4-p-D-glukosových jednotek nativní polymer je ve formě vláken bez poresní struktury, reinformovaná celulosa je ve formě kuliček snáší pH 3 až 10, stabilnější je při kyselé oblasti pH, při pH 7 může být autoklávována vláknitá celulosa se dodává jako suchý prášek - Whatman, BioRad, Schleicher & Schuell - v roztoku je náchylná na mechanické poškození (NE magn. míchání) aktivace - karbonyldiimidazol a divinylsulfon (JF chloroform iát —OH -OH CI-CO-0-CH,CH, ■ HCI, CH,CH,OH R-NH, —O -OH celulosové částice, průměr kolem 450 um Polyakrylamidové nosiče • v biochemické oblasti velmi oblíbené • připravují se kopolymerací akrylamidu a N,N'-methylen-bis(akrylamidu), probíhá radikálovým mechanismem v přítomnosti tetramethylendiaminu (TEMED) a peroxodvojsíranu amonného jako iniciátoru • Bio-Gel P dodává materiál firma BioRad - póry poskytují vylučovací limity od 2 do 400 kDa - nízké nespecifické vazby - dobrá pH stabilita (2-10) • nevýhodou je malá mechanická stabilita - variabilita matrice při změně složení pufrů - nízké průtočné rychlosti • aktivace se nejsnáz provádí částečnou hydrazinolýzou při 50 °C - dostupné jsou i preaktivované materiály (Enzacryl) • glutaraldehydem - uplatní se adice amidové skupiny na dvojné vazby přítomné v polymerní formě glutaraldehydu. Trisacryl ■ kopolymerace: ■ dodáváIBF J-akryloyl-2 amino-2 hydroxymethyl-1,3 propandiol H,C=C-CO—N—C(CH,OH), 2 H H NH-C(CH2OH)3 NH-C(CH2OH)3 CO I CH,-CH-CH, r CO i ■CH,-CH- H H H,C=C- N-CO-C-C-CO- N-C=CH, H H OHOH H H N,N'-diallyltartradiamid NH CO trisacryl CH-OH CH-OH CO NH-C(CH2OH)3 NH CO -CH. -CH-CH,-CH- tris(hydroxymethylové) uskupení poskytuje materiálu výborné hydrofilní vlastnosti zesíťovaný charakter přináší zlepšení mechanických vlastností oproti polyakrylamidu tolerance pH je od 1 do 11 snáší zmražení, teploty do 120 °C a organická rozpouštědla aktivace je možná pomoci - karbonyldiimidazolu - bromkyanu - divinylsulfonu Sephacryl • na bázi dextranového gelu s vnesenými allylovými postranními skupinami zesíťovanými pomoci N,N'-methylen-bis(akrylamidu) • obsahuje tedy lineární glukosové řetězce spojené přes molekuly bis(akrylamidu) a také lineární části polymerního bis(akrylamidu) • Sephacryl S-300 a S-400 - vylučovací limity 1,5 a 8 MDa • gely HR řady - vylepšené průtočné vlastnosti • materiál je dostatečně chemicky i mechanicky odolný • aktivace - přes sekundární hydroxylové skupiny 10 Methakrylátové matrice CH,OH O H2C=C-C-0-CH2-j;-CH2-0-^-C=CH2 CH, CH,OH CH, H-[-0-C-C-]^-OH 0 ° n / \ H,C=C-C-C-C-CH, 2 i H, H CH, 2 CH30 OH ■- H O-C—C—C-f-O-C—C-fc-O-- CH, i 2 CH2 H3C— —► =0 0 1 CH, i 2 HC-OH i C....... H, '2 "2 TSK I pentaerythritol dimethakrylát II polyethylenglykol III glycidylmethakrylátu TSK-Gel Toyopearl (vyr. Tosoh, distribuce Merck jako Fractogel TSK) - kopolymerace glycidylmethakrylátu, pentaerythritol dimethakrylátu a polyethylenglykolu - velký počet hydroxylů a etherových vazeb částečně hydrofilní, výborné mech. vlastnosti, tolerancí pH 2 až 12 velikosti S („superfine", 20 až 40 um), F („fine", 30 až 60 um) a C („coarse", 50 až 100 um) CH3 + O O ii ii H2C=C-C-0-CH2-CH2-C—C-C=CH2 CH, CH, CH.0 H,C- O CH, O-C-C-0 -j-CH3 CH, O -CH, H,C- CH, CH, H,C- -o-c-c-o- -CH, CH ,0 O CH, poprvé připraven v Československu - vzniká kopolymerací 2-hydroxyethylmethakrylátu se síťujícím ethylendimethakrylátem - zesíťovaná struktura vytváří makro i mikropóry, které poskytují vysokou odolnost vůči tlaku chemická odolnost je pro pH 2 až 12 tepelná odolnost až do 170 °C dodávané velikosti částic jsou 5,10 a 60 um - v tuzemsku nyní vyrábí firma Tessek, k dispozici i předaktivované matrice s různými reaktivními skupinami o o II II H,C=C-C-NH-CH,-NH-C-C=CH, ÍH3 CH3 G ?»■ ?"2 + Ä í"2 H,C—C-C-O-C-CH HC—C-NH, O H H, H, I I 2 Y, CH, O O CH, _ 11 | M II | 2 H2C-C-C-NH2 -► KC-C-C-N-C—N—C-CH ru 1 H H, H I n CH3 O CH, 2 CH, / \ H I 2 I 2 / \ H,N-C-C-CH, HC-C-O-C-C-CH. + 2 i 3 I H, H, H O CH, CH. 2 2 /\ H,C=C-C-C—C-C-CH, H H, H, H 2 - kopolymerací methakrylamidu, N,N'-methylen-bis(methakrylamidu) a složky s oxiranovou skupinou, glycidylmethakrylátu nebo allylglycidyletheru (na obr. dole) - Rohm Pharma, v USA jako Spectra/Cryl porézní částice 30,150 a 250 um, neporézní 1 um, mechanická stab. imobilizace probíhá adicí na oxiranové uskupení - reagovat mohou primární aminy, sulfhydrylové skupiny či hydroxyly - doporučována přítomnost fosfátového pufru, urychlí se tím reakce a může probíhat blízko neutrálního pH Srovnání reakčních parametrů Aktivní skupina Reagující skupiny ligandu Reakční podmínky epoxy - NH2 -OH -SH -COOH pH 5-12 doba 4 - 72 hod teplota 4 - 60° C bromkyan - NH2 pH 7-10, doba 1 -12 hod, teplota 4 - 25° C divinylsulfon - NH2 -OH -SH pH 6-11, doba 2 - 24 hod teplota 4 - 25° C tresyl - NH2 pH 7-9, doba 2-16 hod, teplota 4 - 25° C Relativní užitečnost aa pro imobilizaci AA zbytek Obsah Dostupnost Reaktivita Stabilita spojení Použití Asp + ++ + + + Arg + ++ - + - Cys - + ++ - - cystin + - + + - Glu + ++ + + + His + ++ + + + Lys ++ ++ ++ ++ ++ Met - - + - - Ser ++ + + + + Thr ++ + + + + Trp - - - + - Tyr + - + + + C konec - ++ + + + N konec - ++ ++ ++ + sacharid, zbytek — ++ ++ + + + Orientace enzymu • nesmí dojít (a) ke změně konformace vazebného místa, aby docházelo k optimální vazbě substrátu (b) • nevhodné je nepřístupné aktivní místo (c) v důsledku sterické zábrany • méně efektivní až nefunkční může být vazebné místo deformované v důsledku distorse (d) • v obou případech může pomoci "oddálení" molekuly enzymu od nosiče použitím vhodně dlouhého raménka (spacer, linker,...) Zachycení enzymu v polymeru • může se jednat o čistě fyzikální zachycení na základě velikosti - v gelu, zapolymerování uvnitř vhodné matrice • kombinace zachycení a kovalentní vazby - derivatizace lyzinových zbytků akryloylchloridem CH2=CH-CO-CI - vzniklý na enzym vázaný akrylamid se pak kopolymerizuje s klasickou směsí akrylamidu a bisakrylamidu • vhodné pro imobilizaci "komplexnějších" systémů obsahujících daný enzym (buňky, organely,...) • metoda je vhodná pouze pro enzymy účinkující na nízkomolekulární substráty • stabilita chymotrypsinu • v závislosti na způsobu imobilizace - volný (a), derivatizovaný akryloyl Cl (b) - zachycený v polymethakryl. _gelu (d), kombinovaně (c) Gelové matrice • enzym se zachytí v průběhu přípravy gelu - alginát, chitosan, želatina, PAG, PVA plus MNOHO dalších polymerů • vznikne tak monolitický materiál • enzym se nechá vsáknout do hotového gelu ve formě kuliček (Sepharosa, Sephadex) a následně se chemicky zesíťuje (glutaraldehydem) • prosté zesíťování nedává geometricky definované tvary • "smart" polymery - mění vlastnosti pod vlivem externích vlivů (pH, teplota, iontová síla) a mohou tak cíleně např. uvolnit vázaný enzym do roztoku Sol-gel • sol-gel proces - vznik „skla" hydrolytickou polymerací monomole-kulárních prekursorů (CH30)4Si tetramethyl-o-křemičitan (TMOS): (CH30)4Si + H20 (CH30)3Si-OH + CH3OH 2 (CH30)3Si-OH (CH30)3Si-0-Si(CH30)3 + H20 2 (CH30)3Si-OH (CH30)3Si-0+-Si(CH30)3 + OH" , H sol enzym -—^ / gelovatění SixOy(M-OH)z(t-OH)4x.2y.2z gel zachycení v pórech J stárnutí a vysychání SixOy + zH+ + (2x-y-z) H20 xerogel (mech. stabilní) Zachycení v membránových systémech • enzym je od pracovního prostředí oddělen semipermeabilní membránou, průchozí pro substráty a produkty • membránová dutá vlákna "hollow fiber membranes" obsahují enzym uvnitř, pracovní roztok proudí okolo - povrch membrány i více než 20 m2/l • jednoduché - není třeba nic optimalizovat • relativně drahé • membrána může být i ve formě váčků ("droplets") - enzym se rozpustí ve vodném roztoku 1,6-diaminohexanu - disperguje se v roztoku 1,6-hexandiové kyseliny v chloroformu - vzniknou kapičky enzymu obalené tenkou membránou z nylonu (Nylon-6,6) • je možné použít i liposomy s enzymem uvnitř Srovnání imobilizačních postupů Charakteristika Adsorpce Kovalentně Entrapment Zachycení v membráně Příprava snadné obtížné obtížné snadné Náklady nízké vysoké střední vysoké Vazebná síla různé silné slabé silné Unik enzymu ana ne ano ne Použitelnost široká selektivní široká univerzální Pracovní problémy vysoké nízké vysoké vysoké Matricové efekty ano ano ano ne Velká difúzni bariéra ne ne ano ano Ochrana před mikroby ne ne ano ano Vliv imobilizace na pH optimum • náboj nosiče posouvá pH optimum • důsledek partitice H+ iontů v mikrookolí enzymu na povrchu nebo v pórech nosiče • posun pH pracovního roztoku může být výhodný pro zlepšení rozpustnosti substrátu či produktu • nativní enzym v roztoku • imobilizace na kladně nebo záporně nabitý nosič E > 1 -í-™" >" / / NA // / \ 1/ S '/ \\ 3 t t í ? í lk pH i s J 1 0 11 vlivy substrát se musí dostat z okolního prostředí do aktivního místa překonává se nemíchaná vrstva na povrchu nosiče - externí difúze poté se pohybuje uvnitř pórů nosiče - interní difúze koncentrační gradienty substrátu a produktu v případě poresního nosiče a pouze reakce a interní difúze b navíc partitice S a P v mikro prostředí nosiče c jako a, navíc externí difúze d kombinace difúzních a parti-tičních efektů partitiční vrstva je cca 1000x tenčí než difúzni vrstva TET KS] ■ f[p] HS] i— ■ f[P] (d) Difúzni kontrola enzymové konverze • při imobilizování velkého množství enzymu se jeho aktivita jakoby zdánlivě ztrácí • efektivní aktivita enzymu na nosiči je mnohem menší než teoreticky navázaná - důsledek difúzních problémů - omezený pohyb substrátu • pozitivní projev - zdánlivá stabilizace imobilizovaného enzymu aktivita skutečně přítomná nalezená aktivita * ^^^^^^^ / ^^^^^ nalezená ^^^^ vnesená aktivita čas Imobilizace pro enzymové biosensory • imobilizace enzymu na povrch fyzikálně-chemického převodníku • využívají se postupy imobilizace zmíněné dříve i další speciální metodiky • nejčastější jsou enzymové elektrody - kombinace enzymu a elektrochemického převodníku • enzymové optody (optrody) - analogie, nosičem je ale obvykle světlovod (optické vlákno) Membrány a biosensory • membrány v biosensorech plní několik funkcí: • imobilizace enzymových molekul - nosná funkce • řízení transportu látek buď prostřednictvím difúzni kontroly nebo ovlivněním selektivity (antiinterferenční) • zlepšení mechanické stability • biokompatibilita Rozdělení a příprava membrán • membrána = porézní prostředí, rozdělení: • hrubě porézní - póry nad 5 nm (skelná frita), permeabilitu ovlivňuje rozdíl hydrostatického tlaku na obou stranách, osmotický tlak se neuplatňuje • jemně porézní - póry 1 až 5 nm (např. acetylcelulosa), rozpouštědlo prochází konvekcí a difúzí, permeabilita je dána velikostí rozpuštěných látek • neporézní (husté) - nevykazují porézní strukturu, rozpouštědlo prochází pouze difúzí • fázová konverze - roztok polymeru ve vhodném rozpouštědle se nalije na pevný povrch a vyčká se odpaření rozpouštědla - polyvinyl chlorid (tetrahydrofuran - THF), acetylcelulosa (aceton), polyethersulonát (dimethylsulfoxid) nebo polyurethan (THF, aceton) • POlvmerace z mono či oligomerů přímo na místě použití (tvorba „in situ") - vhodná k přípravě fragilních gelovitých membrán (polyvinylalkohol, polyakrylamid), které obsahují velký podíl vody ĺ\uĺ\i\ÍBÔí]ÍI lyofbcl DÓíl{ -tzv. nukleární membrány (Nucleopore) - vrstva polymeru se „prostřílí" urychlenými nukleony, pak se naleptá Úpravy membrán Nucieopore membrána • velikost pórů membrány lze dodatečně změnit: • zvětšení průchodnosti se dosáhne naleptáním polymeru membrány, které vede ke zvětšení průměru pórů - alkalická hydrolýza acetylcelulosy nebo polykarbonátů • zmenšení průchodnosti a zlepšení permselektivity se dosáhne depozicí vhodných látek uvnitř pórů - např. organosilanů nebo lipidických látek • symetrické membrány - obě strany jsou rovnocenné, průchodnost oběma směry je stejná • asymetrické membrány - připravují se na rozhraní dvou fází Mechanické zachycení enzymu převodník a kroužek jdialyzační , membrána nejjednodušší - kápne se roztok biokomponenty na povrch převodníku a překryje se dialyzační membránou alternativní metodou je zachycení biomolekul uvnitř vhodného polymeru (inkluze), polymerní vrstva se vytvoří na povrchu podpůrné dialyzační membrány Zachycení v gelu * Želatina je často používána pro enzymové membrány; 5% roztok se rozpustí při zvýšené teplotě (až 50 °C) a přidá se enzym, promíchá se a naleje na podložku (např. dialyzační membrána) • Nafion je polymer rozpuštěný ve směsi alkoholů s vodou - používá se pro tvorbu permselektivních membrán - jako iontoměnič - může zachycovat biomolekuly -[(CF2-CF2)m —CF-| "CF2]n- 0 1 Nafion CF2 1 \ CF3 —CF- -0-CF2-CF2—S03H J P Zachycení v PVA polyvinylalkohol je hydrofilní, neutrální a biokompatibilní polymer, ve vodě silně bobtná; dostupný ve formě oligomerů (90 kDa), které po zesíťování vytvoří konečný polymer radiační polymerace využívá ozáření směsi oligomerů a enzymu y-zářením (generuje 60Co) - vzniklé radikály vyvolají další polymeraci a zesíťování - výsledná membrána neobsahuje žádné nežádoucí produkty a současně je sterilizovaná chemické síťování - triisokyanát\ (TIC), spojí postranní hydroxyly UV polymerace - PVA obsahující styrylbipyridiniové skupiny (PVA-SbQ, 1.3%) - vůbec nejšetrnější postup imobilizace pomocí PVA OCN—(\ /)—CH2 -N=C=0 +HO--► —NH-C-O- zesítění h m Multifunkční polymery • kombinují imobilizaci enzymu s polymern strukturou nesoucí skupiny mediátorů přenášející elektrony, tzv. redox relays • poly-4-vinylpyridin (oligomer kolem 50 kDa) m se částečně komplexuje s osmiem (mediator), a částečně se do něj kvarternizací zavedou aminoskupiny • směs modifikovaného oligomerů, enzymu a činidla PEGDE (polyethylenglykoldiglycidylether) se nanese na elektrodu 0 © -I 0 © pare. komplexace (1/6) + Os(bpy)2CI2 Os(bpy)2CI CH2-CH2-NH2 PEGDE H2C-CH-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2C^I-CH2 O O Zesíťování enzymu na povrchu S 0=CH—(CH2)3-CH=0 retikulum • zdaleka nejčastěji se používá glutaraldehyd; jeho směs s roztokem bílkoviny v závislosti na koncentraci složek vytváří spontánně retikulum buď přímo na povrchu sensoru, nebo na vhodném podkladovém materiálu (polyamidová síťka, dialyzační membrána) • reakcí mezi aldehydovou skupinou činidla s aminoskupinou bílkoviny (postranní lyzinové zbytky) vzniká propojením Schiffova báze, která se ještě může zredukovat na stabilnější aminovou vazbu 22