Enzymové reaktory ■ nádoba, kde probíhá konverze substrátu prostřednictví enzymové reakce - enzym ve volném stavu nebo imobilizovaný ■ základní rozdělení: - vsádkové („batch") - průtočné nebo kontinuální („flow-through", ..continuous") ■ hodnocení činnosti - stupeň konverze a [S]0-[S] [P] oí = —--=- [S]0 [S]0 Vsádkové reaktory -j STR nádoba s míchadlem „stirred tank reactor" ■ M R vsádkový membránový reaktor - enzym zadržován v dutých vláknech - možnost opakovaného použití enzymu ■ společné vlastnosti: - enzym i substrát mají shodnou dobu setrvání v reakční směsi - nákladnější provoz, obtížnější kontrola (proměnlivost náplně) - jednoduchost, obtížné zvětšení rozsahu („scale-up") ■ kinetika = integrovaná MM rovnice VmJ = [P] + Km ln [S]° = a[S]0 - Km ln(l - a) 1 Kontinuální reaktory PBR CSTR vstup S proud plynu ■ PBR „packed bed reactor" - průtočná kolona naplněná nosičem s imobilizovaným enzymem ■ CSTR ..continuous flow stirred tank reactor" = kontinuálně provozovaná varianta vsádkového STR ■ CMR ..continuous flow membrane reactor" = kontinuální varianta MR ■ FBR „fluidized bed reactor" - proud plynu (nebo nástřik substrátu) udržuje imobilizovaný enzym ve vznosu Proudění vs. uspořádání ■ pohyb kapaliny a způsob proudění (laminární / turbulentní) má výrazný vliv na produktivitu reaktoru ■ hodnocení - empirické bezrozměrné faktory ■ Reynoldsovo číslo Re - dává do souvislosti setrvačné síly vznikající při toku kapaliny a viskozitu (odpor prostředí v důsledku vnitřního tření) - malé Re - laminární proudění - kritické Re - přechodová oblast - velké Re-turbulentní proudění ■ závisí na konfiguraci systému: Re = Lfmlr\ nebo Re = Lflv - L charakteristická délka (průměr obtékané částice, průměr trubky, ...), fm rychlost toku hmoty [g nv2 s1], /je lineární rychlost toku [m s1], ti je dynamická viskozita [g nr1 s1], v kinematická viskozita [m2 s1] - pro míchané systémy se uplatní rychlost míchání a průměr míchadla Kinetika Í[S1 Ju ■ celkový objem reaktoru je V, průtoková rychlost u [m3 s1], enzym s parametry KM, Vmax ■ gradient substrátu d[S]/dV, substrát co do elementu přiteče a bude konvertován: d[S]; VmJS] Km+lS] sdružení parametrů: element äV [S]„ ^M+[S] [S] d[S] = ^ + 1 d[S]=-^dV [S] J u ■ integrace v mezích 0, l/a [S]0, [S]: [S]0-[S]-/řMln _[S]_ [S]0 v v max ^^ = a[S\-KM\n(l-a) u podíl VIu má význam doby zdržení substrátu v reaktoru l/maxl/pak značí reakční kapacitu (odpovídá aktivitě enzymu) PBR ■ je výhodnější turbulentní režim toku - lepší promíchávání a přenos tepla ■ efektivita je nejvyšší na vstupu a nejnižší na výstupu důsledkem gradientu koncentrace substrátu ■ používají se rel. malé částice (1 až 3 mm), mechanicky pevné - komprese by velmi komplikovala průtok a snížila katalyticky účinnou plochu a pohyb média v pórech ■ prakticky nelze regulovat pH, regulace teploty obtížná ■ formování kanálků uvnitř náplně vede k nehomogennímu průběhu konverze ■ médium je vhodnější pouštět směrem zdola nahoru - přiblížení k ideálnímu chování 3 Kinetika CSTR ■ chování lze popsat na základě zákona zachování hmoty - rozdíl koncentrací substrátu na vstupu a výstupu znásobený průtočnou rychlostí je roven rychlosti enzymové reakce: lze upravit: ([S]0-[S])+iřM[SÍ^S]=^ [SJo u případně vyjádřit pomocí stupně konverze: V V a u (1 - a) enzym je obvykle imobilizován - částice se nesmí vymývat výhody: - jednoduchá konstrukce, nízké náklady, výměna náplně enzymu snadná, kontrola pH a teploty snadná, odvod plynných produktů CSTR ■ výhody zředění přitékajícího média - nevadí tak výrazně inhibice (inhibitorem či substrátem) ■ odchylky od ideálního chování nastávají při neefektivním míchání ■ distribuce molekul v reaktoru v závislosti na době zdržení („residence time") - relativní normalizované V [inertní molekula] vyjádření pomocí doby V výměny 1 objemu reaktoru [ ptV ,\[S1 * ^^^^^^^ C 12 3 4 ^normaliz — ^ 4 Stupeň konverze pro PBR a CSTR ■ v závislosti na norm. 1 -°( rychlosti průtoku ■ pro vyšší průtoky a 1 i 0.5 - \\\\ PBR \\\ \ ---CSTR se rozdíly mezi PBR \ ^W^S*. IS]o'Km a CSTR ztrácí... ^----^^===? n , 10 uo 12 3 4 normaliz — M "max Stupeň konverze pro PBR a CSTR 1.0 ■ v závislosti na norm. době zdržení a o.y y/ ' ■ pro vyšší průtoky 0.5 "// / [S10/,CM i/ft jf lib f se rozdíly mezi PBR 11 / - PBR a CSTR ztrácí... J / ---CSTR QE-1-1-1- 0 5 10 15 ^normaliz - ^UlV 5 FBR ■ chování je někde mezi PBR a CSTR ■ enzymová náplň je udržována ve vznosu - proudem substrátu zdola nahoru - bubláním plynem - velikost částic 20 až 40 u.m (velká katalytická plocha), uniformní ■ výhodné pro reakce zahrnující plynné produkty ■ obtížný „scale-up", jen cca 10 až 100x - u PBR jednoduše až 5000x ■ činnost citlivá na fluktuace průtočné rychlosti média Praktické použití enzymových reaktorů ■ velikost výrobní kapacity na bázi kontinuálního procesu je obvykle o 2 řády menší než srovnatelné použití rozpustného enzymu Enzym EC Produkt aminoacylasa 3.5.1.14 L-aminokyseliny aspartát amoniak-lyasa 4.3.1.1 L-asparagová kyselina aspartát 4-dekarboxylasa 4.1.1.12 L-alanin [kyanjdasa 3.5.5.x kys. mravenčí (z odpad, kyanidů) |glukoamylasa 3.2.1.3 D-glukosa glukosa isomerasa 5.3.1.5 fruktosový syrup histidin ammoniak-lyasa 4.3.1.3 urokanová kyselina hydantoinasa 3.5.2.2 D- a L-aminokyseliny invertasa 3.2.1.26 invertní cukr laktasa 3.2.1.23 bezlaktosové mléko lipasa 3.1.1.3 náhražky kakaového másla nitril hydratasa 4.2.1.x akrylamide penicillin amidasa 3.5.1.11 peniciliny rafinasa 3.2.1.22 odstranění rafinosy thermolysin 3.2.24.4 as parta m Fruktosový sirup ■ od 1940 - vývoj glukoamylasy vedl k snadné produkci glukosových sirupů, ale komerční komplikace - ty jsou ale málo sladké (pouze cca 70% sladkosti sacharosy) - menší rozpustnost - buď udržovat roztoky teplé, nebo naředit (pak zase hrozí mikrobiální atak) - proto se použitím glukosaisomerasy (objevena kolem 1950) převede polovina na fruktosu (2x rozpustnější, o 30% sladší než sacharosa) ■ v současnosti enzymy z Actinopíanes missouriensis, Bacillus coagulans a Streptomyces sp. Ekonomika procesu Parameter Batch (soluble Gl) Batch (immobilised Gl) Continuous (PBR) Reactor volume (m3) 1100 1100 15 Enzyme consumption (tonnes) 180 11 2 Activity, half-life (h) 30 300 1500 Active life, half-lives 0.7 2 3 Residence time (h) 20 20 0.5 Temperature (°C) 65 65 60 PH 6.8 6.8 7.6 Colour formation (A42o) 0.7 0.2 < 0.1 Product refining Filtration C-treatment Cation exchange Anion exchange C-treatment Cation exchange Anion exchange C -treatment Capital, labour and energy costs, £ tonne"1 5 5 1 Conversion cost, £ tonne"1 500 30 5 ■ použije se 45% roztok glukosy, konverze na fruktosu je 42% ■ rozsah 10 tis. tun za měsíc ■ 1 kg enzymu vyrobí 10 až 11 tun fruktosového sirupu Rafinasa (a-D-galaktosidasa) ■ odstranění rafinosy při výrobě sacharosy ■ bylo třeba najít organismus produkující galaktosidasu, ale NE invertasu - plíseň Mortierella vinaceavar. raffinoseutilizer ■ lze použít přímo vysušeného mikroba, přidá se k výluhu z cukrovky, používá se STR ■ uvolněná galaktosa se zničí v prvních výrobních krocích při čeření výluhu zahrnujících alkalické prostředí ■ imobilizovaná rafinasa také slouží k odstranění rafinosy a stachyosy ze sojového mléka (vadí tam při speciálních dietách, působí nadýmání) Imobilizovaná invertasa ■ 1941-6 - scházela kyselina při výrobě tzv. "Golden Syrupu" - náhražkou tedy byla invertasa z kvasnic - autolyzované kvasnice, vyčeřené, pH na 4.7, filtrace přes síran vápenatý, adsorpce na aktivní uhlí z masokostní moučky (stejně se používalo pro odbarvování...) - výborná stabilita (akorát to napadali mikrobi a přestalo to odbarvovat...) - akorát že produkt neměl mírně nakyslou chuť ■ nyní se to ještě navíc zesíťuje pro zvýšení stability 8 Příprava aminokyselin ■ aminoacylasa z Aspergillus oryzae slouží pro štěpení racemické směsi z chemické přípravy N-acyl-DL-aminokyselin: h I] r,-c-c-c l- ^c=o r<—9—c—o- aminoacylase R_tí_»_i n DL- + HiO -*-Rl , c 0 + D- Hfl —C = 0 I ^ HN—C = 0 +nh3 N-acyl-DL-amino acid_L-amino acid_N-acyl-D-amino acid -> produkty se snadno separují krystalizací, zbylé N-acyl-D-aminokyseliny se racemizují (chem. nebo enz.) a vráti se do procesu ■ enzym imobilizován na DEAE-Sephadexu, reaktivace prostým přidáním nového enzymu Hydantoinasa RCH=0 +HCN +(NHJ2C03-RCH-CN + NH4HC03 + H20 NH2 ■ nové i přírodní aa - chemickou konverzí z aldehydů přes DL-aminonitrity na racemické RH DL-hydantoiny --c NH ■ následuje enzymová hydrolýza pomocí hydantoinasy a karbamoylasy, oba enzymy / o"-' N z Arthrobactera DL-hydantoin RH HRC-o- \=0J2Í^™» Ĺ +HRC—1=0 +NH3 +C0: 0"^ "fj C^O NH2 DL-hydantoin | NH2 ■ D-aminokyseliny lze připravit hydantoinasou z Pseudomonas striata, zbylé L-hydantoiny se racemizují v alk. prostředí 9 Kyselina L-asparagová ■ v potravinářství, farmaceutickém průmyslu, pro výrobu aspartamu (nízkokalorické umělé sladidlo) ■ výroba z kyseliny fumarové pomocí aspartát:amoniaklyasy z E. coli: HOOC-CH=CH-COOH + NH3 . HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH ■ celé buňky E. coli se imobilizují v karageenanovém gelu, zesíťuje se glutaraldehydem a hexamethylendiaminem ■ monomer pro přípravu polymerů ■ vzniká adicí vody na akrylonitril: CH2=CH-CN + H2Q — - CH2=CH-CO-NH2 ■ lze použít Cu+, ale výtěžek je malý a vznikají další balastní produkty (polymerace, kys. akrylová, ...) ■ použití nitrílhydratasy (často chybně zvána nitrilasou) - pochází z Rhodococcus sp. - velmi nízká amidasová aktivita - celé buňky se zapolymerují v zesíťovaném polyakrylamid/dimethylaminoethylmetakrylátovém gelu, Odstranění kyanidů ■ z průmyslových odpadních vod ■ detoxifikace krmiv a potravin obsahujících amygdalin ■ použijí se kyanidasa: HCN+2H20 HCOOH + NH3 ■ a kyanid hydratasa: HCN + H2Q » HCO-NH2 11