Enzymové značky ■ jedna molekula značky při detekční enzymové reakci konvertuje mnoho molekul substrátu - chromogenní, fluorogenní nebo poskytující jiné detekovatelné produkty ■ takže je zde využit jistý zesilovací mechanismus ■ nejběžnější využití je v bioanalytice - v imunochemických technikách typu ELISA ELISA > enzyme linked immunosorbent assay" > enzymové konjugáty („tracery") slouží pro detekci vzniku a množství imunokomplexů > enzymová značka se zachytí v komplexu na pevné fázi - povrch zkumavky, mikrotitrační destičky, imunostripu > přidáním substrátové směsi se vyvolá barevná změna ♦ ♦ kompetitivní enzymová značka ♦ sendvičová (vicevrstevná) protilátka ^ analyt Vlastnosti enzymu vhodného pro značení ■ dostatečně vysoká aktivita - vysoké číslo přeměny ■ stabilita ■ snadná detekovatelnost ■ skupiny vhodné pro konjugaci - konjugáty lze připravit mezi zvoleným enzymem a značenou komponentou - výhodně lze používat univerzálně např. biotinylované enzymy nebo protein A (G) - enzymové konjugáty Peroxidasa ■ z kořenů křenu (HRP, „horše radish peroxidase", EC 1.11.1.7) ■ malý (40 kDa) oxidoredukční enzym s hemem (protohem IX) v aktivním místě, glykoprotein, katalyzuje oxidaci široké škály substrátů pomocí peroxidu vodíku (i MeOOH a EtOOH) ■ donory fenolické povahy nebo aromatické aminy, které jsou bezbarvé (leukoformy) a po oxidaci vznikají intenzívně barevné produkty ■ pH optimum je 5 až 7, stabilita při pH 4 až 10 ■ enzym je inhibován mimo jiné azidem, kyanidy a sulfidy ■ mnoho isoenzymů, komerčně dostupná HRP C HKP + H2O2-* Compound I Compound I + AH^oxidisable Substrats)-i Compound II + AtP Compound II + AHa->HRP + A.H 2A.H-íOxidized product ■ peroxidasa ze sojových bobů (40 kDa) je termostabilní (do 90 °C) a aktivní v širokém rozsahu pH 2 až 10 2 Konjugace peroxidasy ■ při tvorbě konjugátů se peroxidasa může jednoduše sledovat a stanovovat na základě absorbance při 403 nm (typické pro hemoproteiny) ■ poměr absorbancí při 403 a 275 nm charakterizuje čistotu enzymu - toto jednoduché stanovení komplikuje existence několika isoenzymů - velmi kvalitní preparáty mají tuto hodnotu (R.Z., reinheitzahl) mezi 3 až 3.4, nemá to ale vazbu na aktivitu ■ reakce mohou využít e-aminoskupiny zbytků lyzinu - ty jsou ale pouze 2, což je velmi málo ■ využívají se sacharidové postranní řetězce - snadno se aktivují pomocí oxidace jodistanem a tak se získají aldehydové skupiny Luminogenní substráty HRP • pro citlivou detekci HRP se používá luminol - 5-amino-2,3-dihydroftalazin-1,4-dion • v nadbytku H202je intensita světla (425 nm) úměrná množství HRP +H2O2 +OH HRP NH2 O coo N2 coo -N2 hv + 3-aminoftalál zlepšení luminiscence (vyšší výtěžek) - přítomnost "enhancers" sloučenin - p-jodofenol, p-fenylfenol - nejde již o záblesk, ale o stabilnější světelný tok - výsledek silně závisí na podmínkách reakce - raději použít komerčně namíchané směsi vyšší výtěžek dává 7-dimethylaminonaftalen-1,2-dikarboxyhydrazid 3 Akridanové luminogeny ■ alternativní substráty pro HRP ■ emise při 435 nm Alkalická fosfatasa • katalyzuje štěpení ortho-esterů kyseliny fosforečné v zásadité oblasti pH (AP, EC 3.1.3.1) • řada isoenzymů, používá se enzym izolovaný z mukosy telecích střev - CIAP, 140 kDa dimer, 2 Zn2+ na podjednotku, vysoké číslo přeměny 3500 S"1 při reakci kolem pH 9,8 (pH optimum je 8 až 10) - aktivována aminoalkoholy (diethanolamin, Tris) ■ uchovává se lyofilizovaná nebo v 3 M NaCI - nesnáší kyselé prostředí - poškozuje ji opakované zmrazování / rozmrazování relativně dobře snáší vyšší teploty - např. v průběhu hybridizace - značka při detekci nukleových kyselin Arg-166 AVíl m Asp-3S9 m His-370 Asp 32? Konjugace ALP příprava konjugátů není snadná a často dochází ke ztrátám aktivity pomocí glutaraldehydu nebo lépe heterobifunkčními činidly SMCC a SPDP - je dobré provádět konjugaci ve fosfátovém pufru, který chrání aktivní místo jako reverzibilní inhibitor komerčně dostupná je ALP s maleimidem (EZ-link od Pierce): 0==O -era o Maleimide Activated Alkaline Phosphatase (AP) Protein-AP conjugate with thioether linkage ■ protilátky se redukují merkaptoethanolem a po dialyse lze provést konjugaci ■ pro zavedení -SH slouží SATA Měření aktivity ' p-nitrofenylfosfát (PNPP, 405 nm), hydrolýzou vzniká nitrofenol - intenzivně žlutý v alkalickém prostředí 1 deriváty fluoresceinu, fluoresceindifosfát • 4-MUP (methylumbelliferylfosfát) • luminogenní substrát - Lumigen PPD - chloro-4-methoxy-4-(3-fosfátophenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]) - patří do skupiny dioxetanových luminogenů - substibuce halegenem v adamantanovém skeletu zlepšuje citlivost detekce (už 600 molekul ALP, zeptomoly) - 477 až (dle enhanceru) 620 nm O-O O-CH, O-CH, + P, + h\ 5 5-bromo-4-chloro-indolylfosfát (BCIP) BCIP ■ hydrolytickou reakcí vzniká indoxyl, který po oxidaci (např. tetrazolium) přechází na modré nerozpustné indigo Galaktosidasa ■ p-galaktosidasa (PGal, EC 3.2.1.23) je velký enzym (540 kDa, 4 podjednotky po 135 kDa) a je tedy snadno inaktivován ■ katalyzuje hydrolýzu galaktosidů, pl 4,6, pH optimum má 7 až 7,5 (enzym z Escherichia coli) ■ má dostatek sulfhydrylových skupin pro konjugační reakce, takže lze jednoduše spojit s protilátkami aktivovanými předem SMCC 6 Gal jako reportér genové exprese ■ enzym může být rozdělen na dva peptidy LacZa a LacZQ - samy o sobě nemají aktivitu - ale spontánně se spojí do funkčního enzymu ■ využívá se v mnoha klonovacích vektorech pro dosažení a-komplementace u speciálních lab. kmenů E. coli - malý LacZa peptid je kódován v plasmidu - velký LacZQje kódován bakteriálním chromosomem - když se DNA fragment vpraví do vektoru a produkce LacZa se přeruší, ztratí se p-galaktosidasová aktivita - základem pro modro/bílý screening rekombinantních klonů Glukosa oxidasa ■ (ß-D-glukosa:02-1 -oxidoreduktasa, EC 1.1.3.4, GOD) ■ dostupná z plísní Aspergillus niger nebo Penicillinum notatum ■ 160 kDa, dimer se dvěma FAD kovalentně vázanými na podjednotky ■ obsahuje asi 16% glykosylových zbytků ■ specifická aktivita preparátů přesahuje 200 lU/mg ■ velmi stabilní ■ v imunostanoveních často "spolupracuje" s HRP, pro kterou generuje peroxid vodíku oxidací glukosy - tunelovací stanovení, imunosensory 7 Ureasa ■ substrátem je močovina - změna pH vyvolaná hydrolysou, měří se - pomocí indikátoru bromkresolová modř při 588 nm - potenciometricky (light addressable potenciometric sensor, na bázi pH ISFETu) - pro imunosensory Lakasa ■ z choroše Coriolus hirsutus, Cu-dependentní 1,4-benzendiol oxidasa (EC 1.10.3.2) ■ oxiduje fenolické substráty pomocí kyslíku - alternativa k peroxidase - menší problémy s dlouhodobou stabilitou substrátové směsi 8 Acetylcholinesterasa ■ vysoké číslo přeměny (105 s-1) 1 z elektrického úhoře ■ vysoká citlivost stanovení ■ substrát acetylthiocholin a DTNB - dithiobis(nitrobenzoová kyselina), Ellmanovo činidlo - poskytuje žluté zbarvení Luciferasy ■ patří mezi oxygenasy, štěpí substrát luciferin za účasti ATP - meziproduktem je luciferyladenylát, ten je poté oxidován - luciferin-4-monooxygenasa, 61 kDa, 550 aa - dochází k emisi světla při 560 nm (žlutozelené světlo), výtěžek asi 0.88 ! ■ zdrojem světluška (firefly, Photinus pyralis), (EC 1.13.12.7) 9 Reakce luciferasy ■ kroky 1 a II jsou enzymové (ligace a oxygenace) n cooh n coamp (d-luciferin) (Luciferyl-adenylate) (Luciferyl-actenylate) (Peroxy-luciferin) (,„) -oO^i^0 ~~ UO^if]* + 002 (Peroxy-luciferin) (oxyluciferin) (iv) [-o-OÍ^Í ] — oJOCsHJ^ (oxyluciferin) (oxyluciferin) Luciferasa z Renilla ■ mořská sasanka ("sea pansy", Renilla reniformis) svítí při dráždění ■ emituje modré světlo 480 nm, přenosem na GFP vzniká zelené záření ■ 36 kDa monomer ■ luciferinem je coelenterazin Luciferasa z brouků ■ zdrojem je "click-beetle", Pyrophorus plagiophthalamus ' různé enzymy emitující od 544 do 593 nm (zeleně až oranžově) - byly geneticky upraveny pro emisi při 611 nm a 544 nm - lučRD červená emise ("Chroma-Glo""), lucGR zelená emise (nebo CBR/uc, CBG/uc) DIPTERA COLEOPTERA Mycetophilidae Staphylinidae Ela se Phengodidae 400 450 500 550 600 Wavelength (nm) 650 700 Luciferasa z bakterií ■ mořské bakterie - luciferasa (EC 1.14.14.3) oxiduje aldehydy (>C8, dekanal, tetradekanal) - Vibrio fischeři, Vibrio harveyi, Photobacterium phosphoreum ■ nemají význam pro použití v eukaryotických buňkách, pouze u prokaryot nad(P)h + fmn + hľ NAD H oxidoreduktasa > nad(P)++ fmnh2 Luciferasa FMNHs + r-cho + 02 -> fmn + r-cooh + hso + hv 11 Geneticky upravené luciferasy ■ světlušky: - luc nativní varianta, luc+ "enhanced", zvýšená luminiscence (vyšší svítivost) - vyžadují zlyzování buněk před přidáním substrátů - h/uc-f optimalizované kodony pro expresi v savčích buňkách, svítí déle, poločas přes 5 hod, "Steady-Glo", h/ucP+ zkrácená stabilita uvnitř buňky, poločas 30 min, "Bright-Glo", h/ucCP+ velmi krátká živostnost - svítí přímo v buněčné kultuře, vhodné pro mikrodestičkový formát - nahrazení C-terminální sekvence Ser-Lys-Leu cílové pro peroxisomy za Ile-Ala-Val ■ u Renilla obdobné: R/uc, hR/uc, hR/ucP, hR/ucCP, nemá C-term. cílovou sekvenci ■ "Dual-Luciferase" - použijí se oba typy luciferas, lyže buněk, dva substráty, postupné měření emise - "Dual-Glo" - stejné, ale přímo v buněčné kultuře ■ optimalizace kodonů pro dobrou expresi v savčích buňkách ■ odstranění skrytých ("cryptic") regulačních a potenciálních sestřihových sekvencí ■ www.promega.com Reportéry genové exprese molekul luciferasy je pro zobrazení potřeba mnohem méně než např. GFP (musí mít silnější promotor, je velmi stabilní) - rychlejší metabolismus (začlenění sekvence pro degradaci - PEST, Pro-Glu-Ser-Thr) - lepší pro zobrazení dynamiky exprese - efektorová specifita, uniformní a optimální exprese v hostitelských buňkách zobrazení žádané linie po úspěšné transfekci - hledání a studium účinku nových léčiv - efekty cizorodých látek na buněčné procesy identifikace interagujících proteinů -společně spustí přepis reportér, genu studium interakcí biomolekul a vzdáleností mezi nimi - BRET - fúze studovaného proteinu s luciferasou (Rluc) a druhého partnera s vhodným fluoroforem (GFP) Luciferasový reportérovy vektor pGL4 pro přenos re porterové ho genu do hostitelských buněk, obsahuje: - promotorové sekvence (HSV-TK, SV-40, CMV) - savčí selekční sekvence (Hygr - resistence k hygromycinu) - poly(A) úseky klonovací místa luc gen (dle volby), • Iuc2 • R/i/cNeo Synthetic-v poly(A) Selectable Marker - None i - Hygror - Neo' - Purty Poly(A) block [for background reduction) - Firefly [Iuc2] ■ Rapid Response™ (-P, -CP) -Reni!la(hR!uc) • Rapid Response™ (-P, -CP) Přehled variant luciferas Vector Reporter Gene Multiple Cloning Region Protein Degradation Sequence Gene Promoter Mammalian Selectable Marker pGL4.10 lucl Yes No No No pGL4.Il \utlP Yes hFEST No No pGL4.12 ludCP Yes CLl-hPEST No No pGL4.13 íhc2 No No SV40 No pGL4.14 luc2 Yes No No Hyg' pGL4.15 hitlP Yes hFEST No Hygi pGL4.16 luclCP Yes CLl-hPEST No Hygi pGL4.70 kRluc Yes No No No pGL4.71 hRlucP Yes hPEST No No pGL4.72 hRlucCP Yes CLl-hPEST No No pGL4.73 hRhic No No SV40 No pGL4.74 kRluc No No HSV-TK No pGL4.75 hRhic No No CMV No pGL4.7ó hRhic Yes No No Hygi pGL4.77 hRlticP Yes hFEST No Hygi pGL4.78 hRlucCP Yes No No Hyg' BRET ■ bioluminiscence resonance energy transfer - neradiační přenos energie z luminiscentního donoru na fluorescentní akceptor - vyskytuje se také in vivo (rod Renilla obsahuje luciferasu emitující modré světlo, BRET přenosem na GFP se ale mění na zelené - účinnost BRET se stanovuje jako poměr intenzit emise akceptoru a emise donoru - eliminují se tak vlivy techniky měření, počtu buněk, prostředí ■ aplikace in vivo - studium interagujících biomolekul - jeden z partnerů se na úrovni DNA sfúzuje s genem luciferasy (rluc), druhý partner pak s genem GFP ■ výhody - není problém s fotorozkladem - lze studovat buňky citlivé na světlo, případně buňky s vysokou přirozenou autofluorescencí ■ při sférických problémech lze použít velmi malou luciferasu z rodu Gaussia (20 kDa) Bioluminiscence vs. fluorescence ■ F - vysoký jas, excitované stavy mohou vznikat rychle díky masivnímu excitačnímu záření (napumpovaní energie) - ale zvyšuje se i signál pozadí, rozhoduje poměr signál/šum - detektory nerozlíši excitační a emitované fotony (geometrická diskriminace ani filtry nejsou 100% účinné) - emitují i nežádoucí fluorofory přítomné v komplexním biomateriálu - uplatní se při zobrazování detailů - rozhraní, kdy S/N nemá takový vliv - mikroskopie, cytometrie, kdy stejně optická konstrukce limituje citlivost detektoru ■ BL - nižší intenzita světla, ale současně prakticky nulové pozadí - uplatní se při "větších" vzorcích, kdy je pouze jednoduchá optika (žádné filtry) a detekce fotonů je tedy efektivnější (detektor blíže vzorku) - stanovení ve zkumavkách, v mikrodestičkách, detaily u větších organismů (myši, ...) - široká lineární oblast (6 až 8 koncentračních řádů) - při bioanalytických stanoveních dosahuje 10 až 1000x vyšší citlivosti a limity detekce (1020 mol, cca 104 molekul/vzorek, několik molekul v buňce) - luminofor je chráněn při emisi uvnitř bílkovinného obalu Acetátkinasa ■ jako značka pro vysoce citlivá imunostanovení ■ generuje ATP z acetylfosfátu a AD P ■ vzniklé ATP se pak použije pro vyvolání bioluminiscence luciferinu s luciferasou ■ citlivost až 10-22 mol Substráte + *- Substráte + ADP 15