Enzymy v praxi částečně zmíněno již u použití imobilizovaných enzymů praktické využití mají samozřejmě i volné enzymy Enzymy pro molekulární biologii přerušují řetězce DNA či RNA spojují řetězce DNA či RNA syntetizují nové řetězce DNA či RNA přidávají nebo odstraňují skupinu fosfátu na koncích nukleových kyselin ochraňují / povlékají / splétají / rozplétají řetězec DNA Enzymy přerušující DNA / RNA endonukleasy - reštrikční endonukleasy, restriktasy (3 typy) - deoxyribonukleasy (DNasy) • DNasa I, fazolová nukleasa (Phaseolus aureus, mung beán) - ribonukleasy (RNasy) • RNasa T1, U2, A, CL3, PhyM, B, H exonukleasy - exonukleasy III a VII - lambda exonukleasa - T7 gen 6 exonukleasa - fosfodiesterasa z jedových žlaz (venom) - fosfodiesterasa ze sleziny endo- a exonukleasy - nukleasa Bal31 - nukleasa z Neurospora crasa - nukleasy P1 a S1 Reštrikční enzymy degradační enzymy, které reorganizují a stříhají DNA ve specifických "střihových" místech = reštrikční místa tři typy: - I: náhodné štípání na nemethylovaných dsDNA délky 4 až 7 kbp - II: štípají v dvojitě symetrické sekvenci dsDNA - III: rozpoznávají specifické penta- nebo hexamerní cílové sekvence v dsDNA, ALE štípají o 25 až 27 nukleotidů dále směrem k 3'-konci DNasy a RNasy DNasaI - degraduje DNA hydrolýzou vnitřních fosfodiesterových vazeb fazolová nukleasa - vysoce specifická pro DNA nebo RNA postrádající uspořádanou strukturu - hydrolyzuje ve směru 5' -> 3' RNasa H - specificky degraduje RNA řetězce v DNA:RNA heteroduplexech Exonukleasy exonukleasa III - 3' -> 5' exonukleasová aktivita plus další tři aktivity, pouze na dsDNA, neúčinkuje na ssDNA exonukleasa VII - účinkuje jak v 3' -> 5' tak v 5' -> 3' směru - specifická pro jednořetězcové nukleové kyseliny - neuvolňuje mononukleotidy lambda exonukleasa - účinkuje v 5'-> 3' směru, na dvouřetězcové nukleové kyseliny Endo- i exonukleasy nukleasa Bal31 - vysoce specifická endodeoxynukleasová aktivita pro jednořetězcové DNA - exonukleasová aktivita dokáže současně degradovat jak 3' tak 5' konce DNA duplexu nukleasa z Neurospora crassa - na ssDNA nebo RNA účinkuje jako endonukleasa - na dsDNA a ssDNA účinkuje jako exonukleasa Ligasy - spojování DNA / RNA T4 DNA ligasa T4 RNA ligasa DNA ligasa z E .coli Step i Step 2. Step 3. Ligase \ + NAD NH-PO3— Adenosine + Ligase \ o- N-T HO OH 5' 3P A„? o' 3' 5' OH V o o _r~ vi ii . =| o- o- 5' 3 OH OH 3' 5' 5' 3 Enzymy syntetizující nové vazby kostry DNA a RNA ■ DNA polymerasa I ■ velký fragment DNA polymerasy I (Klenowův fr.) ■ T4 DNA polymerasa ■ modifikovaná T7 polymerasa ■ Taq polymerasa ■ RNA polymerasa - bakteriální - z bakteriofága (T3, T7, SP6) ■ reversní transkriptasa ■ poly(A)-polymerasa ■ terminálni deoxynukleotidyltransferasa ■ polynukleotidfosforylasa Enzymy přidávající / odstraňující fosfoskupinu na koncích NA ■ T4 polynukleotidkinasa ■ alkalická fosfatasa ■ kyselá pyrofosfatasa z tabáku 5 Enzymy (a další proteiny) co chrání, rozvíjí nebo zavinují DNA DNA methylasy proteiny vážící ssDNA nebo ssRNA - RecA protein, SSB protein, Gen 32 protein topoisomerasy Enzymy v průmyslu v praxi využívány od nepaměti (součást biol. materiálů) alkoholové kvašení (kvasinky), změkčování masa (proteasy), srážení kaseinu (chymosin z telecích žaludků) průmyslové enzymy - velká možství (tuny/rok) - může být i nízká čistota - nízká cena (~$5-40 / kg)... relativně nízký zisk speciální enzymy - malá produkce (g až kg/rok) - vysoká čistota - vysoká cena (~ $5 - 10 000 / g)... vysoký zisk roční nárůst výroby a spotřeby o 10-15%, hodnoty o 4-5% Rozdělení dle účinku ■ podle substrátu - hydrolyzující proteiny 59% - hydrolyzující sacharidy 28% - hydrolyzující lipidy 3% - speciální (bioanalýza, zdravotnictví, výzkum) 10% Průmyslové proteasy Enzym preferované místo štěpení3 (N-konec-MD-konec) bromelain -Lys^-Z; -Arg^-Z; -Phe^-Z; -Tyr^Z chymotrypsin -Trp-Z; -Tyr-Z; -Phe-Z; -Leu-Z papain -Phe-AA^-Z; -Val-AA^Z; -Leu-AA^Z; -Ile-AA-^-Z pepsin -Phe(or Tyr,Leu)-Trp(or Phe,Tyr)- thermolysin -AA^-Leu-; -AA^-Phe-; -AA^IIe-; -AA^ Val- trypsin -Arg^-Z; -Lys^-Z a AA libovolné aminokyseliny, Z aminokyselina, ester nebo amidový zbytek. Místo štěpení platí pro purifikované enzymy. 7 Proteasy jsou schopny katalyzovat vznik polymerů z konc. roztoků bílkovin, peptidů nebo aminokyselin (plasteiny) využívá se pro odbarvování a odstranění špatné chuti (sojové proteiny, biomasy) syntetické využití při tvorbě peptidů - využití stereospecifity, omezení nutnosti chránění postranních skupin - důležitá volba pH, vhodné další skupiny usnadňující precipitaci produktů - kinetická kontrola - přenos skupiny ne na vodu, ale na alternativní AK nebo peptid, co je silnějším nukleofilem než voda: 0 H II + R^-C-X enzyme O H R^-C-X -enzyme H20 O R1-C- fc- || R,-C- -XH -OH Ri- R2-O H -C-N- Prací prostředky biodetergenty - možnost praní při nižších teplotách se stejnou účinností jako „klasické" prostředky a-amylasy ... odstraňování škrobového pojidla z textilních vláken, v prostředcích do automatických myček termostabilní, alkalické bakteriální proteasy lipasy - rozklad mastnoty Kvasný průmysl - výroba piva přídavky a-amylasy (hydrolýza 1,4-a-glukosidických vazeb uvnitř polysacharidové molekuly - ztekucování škrobu, lepší filtrovatelnost) a p-amylasy (odštěpují maltosové jednotky z neredukujícího konce polysacharidu) - degradace dextrinů (vyšší podíl alkoholu) přídavek pullulanasy (štěpení a-1,6- větvení škrobu) p-glukanasa - snižování nežádoucí viskozity beta glukanů glukoamylasa (odštěpuje glukosy od neredu kujícího konce) -odbourávání zbytkových dextrinů v pivu - vyšší stupeň prokvašení, diabetické pivo papain - enzymové stabilizátory piva (odstraňování chladových zákalů) - bránění vzniku polyfenolových komplexů bílkovin, ale nadměrná hydrolýza bílkovin nežádoucí Sacharidy ze škrobu úpravy pH brambory kukuřice I I \ alkalické alkalické škrob NaOH pH 3.5-4.2 ztekucení HCI pH 6.0-6.2 105 °C, 5-8 min 95 °C, 1-2 hod sacharifikace NaOH 3^. pH 4.2-4.5 60°C 36-48 / 96 hod isomerisace pH 7.8 60°C 0.3-3 hod Enzym: a-amylasa glukoamylasa + pullulanasa glukosaisomerasa Mlékárenství 1 mléčné produkty - chymosin (syřidlo) srážení bílkoviny kaseinu po jeho rozštěpení - lipasy-zrání sýrů, specifická vůně a aroma - (3-galaktOSÍdasy štěpení laktosy - výroba delaktosovaného mléka pro intolerance vedoucí k gastrointestinálním obtížím, galaktosa a glukosa se metabolizují snadno; mléko pro výrobu zmrzliny (zabránění krystalizace laktosy) His Phe-Met Lys um i ic 98 105106 111 K-casein Chymosin His Phe Met Lys n mmm I I ic 98 105 106 111 para-K-casein glycomacropeptide Celulasy komplexní enzymový systém katalyzující hydrolýzu celulosy celulasa z Trichoderma viridae -> odbourání nativní celulosy zpracování celulosové suroviny (dřevěné odpady, odpadní papír) výroba instatních potravin (káva, čaj), digestiva pro krmné směsi, lepší účinnost extrakce šťáv z rostlinných materiálů a ovoce Lipasy postupná hydrolýza lipidů - triacylglyceroly diacylglyceroly monoacylglyceroly glycerol + uvolněné mastné kyseliny rychlost se postupně snižuje - totální hydrolýza je obtížná heterogenní reakce (lipidy jsou nerozpustné ve vodě) ovlivnění chuti a vůně potravinářských výrobků (výroba sýrů) součást digestivních přípravků Enzymy v organických rozpouštědlech voda je nevhodné médium pro většinu reakcí organické chemie mnohé reaktanty (kyslík, steroidy, lipidy) jsou mnohem rozpustnější v organickém rozpouštědle mnohé produkty jsou ve vodném prostředí labilní nadbytek vody (55,5 M koncentrace) často upřednostní hydrolytické reakce proti jiným užitečnějším procesům - transesterifikační reakce esteras a lipas - posun termodynamických rovnováh žádoucím směrem - enzym sám jako katalyzátor nemění velikost rovnovážné konstanty katalyzované reakce! stabilizace - nehrozí mikrobiální kontaminace velmi často zde enzym funguje v dvoufázovém systému - usnadnění separačních kroků polaritu prostředí charakterizuje partiční koeficient log P - rozdělovači poměr daného rozpouštědla mezi oktanolem a vodou Enzymy v organických rozpouštědlech v zásadě existují dvě možnosti: téměř bezvodý enzym je suspendován v organickém rozpouštědle - na jeho povrchu je velmi tenká vodná vrstvička enzym je rozpuštěn v reverzních micelách tvořených molekulami surfaktantu a kosurfaktantu - surfaktant: cetyltrimethylamonium bromide (CTAB), bis(2-ethylhexyl) sulfosukcinát Na (AOT), fosfatidylcholin, tetraethylenglycoldodecylether -nachází se na rozhraní vodné (a) interfáze a org. rozpouštědla kosurfaktant (butanol, hexanol, oktanol) - pokud je přítomen, tak modifikuje polaritu interfáze Polarita prostředí aktivita enzymu je úměrná polaritě prostředí vyjádřené pomocí log P ve speciálních případech může být užitečné použít těžkou vodu D20 příklady log P pro nejčastěji používaná rozpouštědla 1Ů0 ? 80 4 é ■f i * J 2! 60 1 f * / > * / £ 40 r i i f 20 Ě i Š J - — — imobiliz. * jŕ i _ - ■S---, ii ■2 0 2 4 6 6 10 12 LogP Solvent LogP Solvent LogP Butanone 0.3 1,1,1-trichloroethane 2.8 Ethyl acetate 0.7 Carbon tetrachloride 2.8 Butanol 0.8 Dibutyl ether 2.9 Diethyl ether 0.8 Cyclohexane 3.1 Methylene chloride 1.4 Hexane 3.5 Butyl acetate 1.7 Petroleum ether (60-80) 3.5 Di-isopropyl ether 2.0 Petroleum ether (80-100) 3.8 Benzene 2.0 Dipentyl ether 3.9 Chlorotorm 2.2 Heptane 4.0 Tetrachloroethylene 2.3 Petroleum ether (100-120) 4.3 Toluene 2.7 Hexadecane 8.7 Enzymy ve zdravotnictví ■ fibrinolýza - cílené rozpouštění krevních sraženin, plasmin, streptokinasa, urokinasa (aktivátory plasminogenu) ■ cílená tvorba krevních sraženin - thrombin ■ trávicí enzymy ■ trypsin, papain, bromelain - čištění ran od hnisu Enzymy jako cíl léčiv enzymy (47 % receptory vázané na G-proteiny (GPCR) ostatní integriny DNA A. L. Hopkins and C. R. Groom, Nature Rev. Drug Discov. 1, 727-730 (2002) iontové kanály transportéry jaderné receptory hormonů dle Spiwok, Kodíček, VŠCHT, Praha, webové materiály 13 Vývoj léčiv ■ cíle léčiv (targets - finding and validation): - biologické studie - genomika, proteomika, transkriptomika ... ■ léčiva mohou být: - nízkomolekulární látky - syntetické nebo přírodní sloučeniny - biopolymery (biotechnologická léčiva) - protilátky, enzymy atd. a další knihovny sloučenin kombinatorická chemie přírodni látky virtuální knihovny miliony sloučenin „lead compounds" slabé ligandy/inhibitory stovky sloučenin SCREENING další výběr .lead compounds" slabé ligandy/inhibitory stovky sloučenin „drug candidate" silné ligandy/inhibitory desítky sloučenin lead optimization chemická synthesa kombinatorická chemie ■CH3 CHřCH3 ■CH?CHjCH3 CH,CHřCF, Kl (riM) 8300 3 TOO 2 000 qJóud -CH;OCH3 2 000 -CHřCH=CH= 2 200 „drug candidate" silné ligandy/inhibitory desítky sloučenin drug preklinické studie jedna sloučenina testy na tkáňových kulturách isolovaných orgánech laboratorních zvířatech Klinické studie ■ 1.fáze - podávání zdravým dobrovolníkům (20 - 100) - studium účinků na tělesné funkce, vedlejších účinků, - farmakokinetiky, určení dávkování ■ 2. fáze - podávání vybraným pacientům (stovky) - „blind"/„double blind" - bezpečnost, účinnost, dávka, farmakokinetika ■ 3. fáze - podávání větší skupině pacientů (stovky až tisíce) - srovnání se standardní terapií - povolovací řízení ■ 4. fáze - zkoušení v praxi, dlouhodobé vyhodnocování Nejprodávanější v USA (2004) název látka účinek cíl výrobce mld USD/rok 1 LIPITOR atorvastatin tuky HMG-CoA reduktasa PFIZER 7.1 2 ZOCOR simvastatin tuky HMG-CoA reduktasa MERCK 5.5 3 PREVACID lansoprazol žaludek H+/K+-ATPasa TAP PHARMA 4.0 4NEXIUM esomeprazol žaludek H+/K+-ATPasa ASTRAZENECA 3.6 5 PROCRIT erythropoietin krvetvorba EPOR JOHNSON & J. 3.3 6 ZOLOFT sertralin deprese,obezita serotonin transporter PFIZER 3.0 7 PLAVIX Clopidogrel oběh.systém AD P receptor BRISTOL-MYERS 2.9 8 Advair Diskus fluticason astma glukokort. rec. GLAXO 2.8 9 ZYPREXA olanzapin hlava serotonin-dopam. rec. ELI LILLY 2.7 10 celebrex celecoxib záněty COX-2 PFIZER 2.7 enzymy . Angiotensin converting enzyme (ACE) EC 3.4.15.1 angiotensinogen Renin Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe-His-Leu angiotensin I bradykininogen Kallikrein DACEC bradykinin Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe angiotensin II inakt. pept. vazba na angiotensinový receptor zužováni cév, růst krevního tlaku 18 Trandolapril HMG-CoA reduktasa EC 1.1.1.34 19 Cykloxygenasa (COX) EC 1.14.99.1 Prostaglandin-endoperoxidsynthasa Arachidonová kyselina dioxygenasa a peroxidasa zároveň Prostaglandin G2 Isoenzymy - COX-1 - žaludek, ledviny prostaglandiny Cykloxygenasa neselektivni (cox-1 & cox-2) 1eqg COX-1 Hem neselektivni (COX-1 & COX-2) O cc OH ^ "O kyselina acetylsalicylová Diclofenac C 300 nM (COX-1) 18 nM (COX-2) NH CK J--. -CI Voltaren' Emulgel' Dihydrofolát reduktasa ec 1.5.1.3 Dihydrofolát reduktasa 21 Trendy enzymy stále zůstávají v popředí zájmu biotechnologie relativně málo enzymů se produkuje ve velkém (> kg) a ve stavu vhodném pro průmyslové nasazení nové enzymy se hledají z přírodních zdrojů a selekcí existujících mikrobiálních kmenů průmyslově rozšířené enzymy nachází další nové aplikace nové enzymy jsou navrhovány metodami molekulového modelování, bioinformatickými technikami a genetickým a proteinovým inženýrstvím jsou navrhovány a syntetizovány nové organické katalyzátory s využitím "enzymologického" know-how začínají se prosazovat i složitější enzymové komplexy "Nepřirozené" substráty mnohé enzymy nejsou zcela specifické pro své přirozené substráty některé mohou katalyzovat i reakce neodpovídající jejich zařazení - např. v nepřirozeném prostředí dvou fází (org. rozpouštědla) - lipasa (hydrolasa) v nevodném prostředí funguje jako transesterasa - řada oxidas může jako akceptor místo kyslíku využívat širokou škálu jiných oxidantů (benzochinon, ferricinium, ferrikyanid, ...) acetylcholinesterasa - příprava L-karnitinu - syntetická racemická směs acetyl-DL-karnitinu, z ní se D-anomer enzymaticky zhydrolyzuje - směs acetyl-L-karnitinu a D-karnitinu se separuje na ionexu - acetyl-L-karnitin je biologicky aktivní stejně jako L-karnitin 0 O -UC-C-OH t H H,C-C-OH CHj-N+—CH, -CH 0 + Hfi CH; -ľ -^ .+—CH^-CHi °. 1 + 1 CHs 0-C-CHj CH-. OH HO-c.-U-3 - ač je rychlostní konstanta pro acetyl-D-karnitin 104x nižší než pro acetylcholin, výtěžnost je stejná (acetylcholin při nadbytku inhibuje...) „Nové" enzymy - požadavky ■ stabilita (teplotní, v rozpouštědlech) ■ substrátová specifita ■ schopnost katalysovat jiné reakce ■ schopnost fungovat jako součást biosensorů ■ alergo / imunogenicita ■ další Enzymy z extremofilních organismů ■ termo- a hypertermofilní - Aeropyrum pernix K1, Aquifex aeolicus VF5, Archaeoglobus fulgidus DSM4304, - Chlorobium tepidum TLS, Idiomarina loihiensis L2TR, - Methanobacterium thermoautotrophicum delta H, Methanococcus jannaschii DSM2661, - Methanopyrus kandleri AV19, Picrophilustorridus DSM 9790, Pyrobaculum aerophilum IM2, - Pyrococcus abyssi GE5, Pyrococcus furiosus DSM 3638, Pyrococcus horikoshii shinkaj OT3, - Sulfolobus solfataricus P2, Sulfolobus tokodaii strain 7, - Symbiobacterium thermophilum IAM14863, Thermoanaerobacter tengcongensis MB4(T), - Thermococcus kodakarensis KOD1, Thermoplasma acidophilum DSM 1728, - Thermoplasma volcanium GSS1, Thermosynechococcus elongatus BP-1, - Thermotoga maritima MSB8, Thermus thermophilus HB27, Thermus thermophilus HB8 ■ psvchrofilní - Colwellia psychrerythraea 34H, Desulfotalea psychrophila LSv54, Methanogenium frigidum, - Methanococcoidesburtonii, Pseudoalteromonas haloplanktis, - Photobacterium profundum SS9 ■ halofilní - Haloarcula marismortui ATCC 43049, Halobacterium sp. NRC-1 ■ radioresistentní - Deinococcus radiodurans R1 Enzymové inženýrství lze vylepšit nebo změnit řadu vlastností výtěžek enzymu z produkčního organizmu - z pomalu rostoucího mikroba, z rostliného materiálu nebo živočišné tkáně se nakloňuje do rychle a snadno rostoucího bezpečného produkčního mikrobiálního kmenu - zvýší se počet kopií genu, co enzym kóduje proteinové inženýrství - izoluje se požadovaný enzym, určí se charakteristiky, složení akt. místa - porovná se s informacemi v databázích, navrhne se lepší struktura - site-directed mutagenesis, nový enzym, pokud není lepší, pokračuje se Gene expression Mutant outification Gene construction Molecular mod e Iii na Structural anatysis Determination of enzyme k structure and properties ^Database Cílená mutace (site-directed mutagenesis) nahrazování 1 nebo více aminokyselin ve struktuře enzymu, probíhá v následných krocích cílené plánování změn - modelování struktury enzymu a potenciálních substrátů, informace o podobných enzymech z DB 13J- Jati ve Native Proposed DNA DNA enzyme enzyme primer 3' N-Terminus ■G T ■C N-Terminus 3' I -c Glycine Glycine -G I I ■T j j -A Methionione Methionine ■C Serine Asparagine jcine Isoleucine -T -A I sole -G -c -G Alanine -T I -G -T Alanine I C-terminus C-terminus -c -c -G -T -A -r. -T -T -r. -T -A -G -C -a -T 5' r Single-stranded DNAtemplate T -i—m—m—i—n—m—r—i—m—i—n—i—r n|ŕ(Ti(rin!pHíiHnn|PHnirin!pn!p i i i i i i i i i i i i i UUÜHfljüHHliH^liUÜH Primer (/I) Polymerase (2) Ligase J i i i i i i i i i i i i i i i i UUÜHJJUHHÜHJjÜUÜH Transform cells J UUDHfllUHHUHrtHlUUH _............... Subtilisin ■ nativní (WT) mutace 1107 G Rhennecker, Biochem. 32 (1993)1199. další mutace Ballinger, Biochem. 35 (1996)13579. sukcinyl—Xxx—Ala—Pro—Phe—p-nitroanilinid Ile107 Xxx - pouze hydrofobní sukcinyl—Xxx—Ala—Pro—Phe—p-nitroanilinid nho Gly107 Xxx - širší specifita sukcinyl—Xxx—Ala—Yyy—Zzz—p-nitroanilinid 5 mutací mutace Y104, 1107 a L126 za kys. AK N62D/G166D Aktivita furinu („furilisin") Cyproase 1 ... cyclophilin z E.coN (A91S, F104H, N106D) serinovým proteinasám ■ endopeptidasa, štěpí před prolinovým zbytkem Náhodné mutace - kombinatorický přístup error-prone PCR - „chybující..." primery ze získané knihovny sekvencí se screeningem naleznou vylepšené varianty enzymu DNA shuffling náhodné kombinování sekvencí z původních genů nukleasy, sonikace atd. genová knihovna DNA-polymerasa Nalezení vhodného kandidáta ■ screening nebo • • • • • •• isolace screening selekce • selekční tlak • • • • •• • ••• • •• • •V afinitní selekce Počítačové metody „in silico" 27 Synzymy - umělé enzymy syntetické poly / oligomery vykazující enzymovou aktivitu - synzymy mají místo vážící substrát a katalyticky aktivní skupiny - první se vytváří rel. snadno, druhé je mnohem náročnější - často je vzorem přechodový stav očekávaný v plánované reakci katalýza odpovídá saturační MM kinetice: synzym + S ^ (synzym-S komplex) synzym + P některé synzymy jsou pouze derivatizované proteiny - přidáním [Ru(NH3)5]3+ k myoglobinu (přenašeč kyslíku) - naváží se na 3 povrchové histidinové zbytky - se získá umělá askorbátoxidasa zcela umělé synzymy - polyglutamová kyselina - esterasová aktivita - hydrolyzuje 4-nitrofenylacetát, pH optimum 5,3, KM = 2 mM - cyklodextriny (toroidní molekuly ze 6 až 10 1,4-D-glukosových jednotek, vytváří hydrofobní komůrku 0,5 až 1 nm širokou a 0,7 nm hlubokou, místo jednoho C-6 hydroxylu se přidal pyridoxal - vznikla transaminasa Abzymy - katalyticky aktivní protilátky protilátky vytvořené proti analogům předpokládaného přechodového stavu očekávané reakce např. fosfonátové estery R-P02-OR' jsou stabilní analogy přechodového stavu při hydrolýze karboxyesterů - protilátky připravené proti této sloučenině fungují jako esterasy - Km v mikromolární oblasti, zrychlení reakce až o tři řády oproti nekatalyzované reakci Molekulární otisky MIPs, molecularly imprinted polymers - analog přechodového stavu je obklopen strukturou polymeru při jeho vzniku - polymer poskytne vhodné skupiny vytvářející vazebné a katalyticky aktivní zbytky - poté se vymyjí templátové molekuly velmi stabilní, odolné při vysokých teplotách ZÁVĚR enzymová technologie prochází fází zralosti a evoluce - zralost - existuje teorie popisující fungování enzymů a vztahy mezi funkcí a primární strukturou a 3D-konfigurací - evoluce - existují široké možnosti vývoje užitečných procesů a materiálů využívajících získané vědomosti budoucnost enzymů je jasně pozitivní - mnohem širší nasazení - objevy nových enzymů - vylepšování existujících enzymů - katalýza nových reakcí enzymologie startuje nové období enzymových technologií