1 Mechanismy enzymovMechanismy enzymovéé katalysy.katalysy. ZZáákladnkladníí principy, typickprincipy, typickéé ppřřííklady.klady. ZZúúččastnastněěnnéé typy interakctypy interakcíí vodvodííkovkovéé mmůůstkystky iontoviontovéé vazbyvazby hydrofobnhydrofobníí a van dera van der Waalsovy interakceWaalsovy interakce 2 EnergetickEnergetickéé hlediskohledisko •• zrychlenzrychleníí 11--substrsubstráátovtovéé reakce 10x vyreakce 10x vyžžaduje zaaduje za podmpodmíínek v bunek v buňňce snce sníížženeníí oo 5,7 kJ/mol, p5,7 kJ/mol, přřitom energieitom energie uvolnuvolněěnnáá vznikem slabvznikem slabéé interakce poskytne 4 ainterakce poskytne 4 ažž 3030 kJ/mol, cokJ/mol, cožž ppřři mnohai mnoha slabých interakcslabých interakcíích dch děělláá 6060 aažž 100 kJ/mol100 kJ/mol •• koncepkoncepččnněě jasnjasnéé pojmy katalysa a specifita se experimentpojmy katalysa a specifita se experimentáálnlněě ttěžěžce odlice odliššujujíí -- oboběě se uplatse uplatňňujujíí ppřřii úúččinku enzymuinku enzymu •• specifita je danspecifita je danáá vznikem mnoha slabých interakcvznikem mnoha slabých interakcíí mezi molekuloumezi molekulou enzymu a substrenzymu a substráátutu -- optimoptimáálnlníí jsou v tranzitnjsou v tranzitníím stavum stavu •• ppřři katalyse se mi katalyse se můžůže paralelne paralelněě uplatnit nuplatnit něěkolik mokolik možžnýchných mechanismmechanismůů (t(těžěžce se odlice se odliššujujíí experimentexperimentáálnlněě)) •• faktory pfaktory přřispispíívajvajííccíí k energii pk energii přřechodovechodovéého stavu:ho stavu: 1)1) snsníížženeníí entropieentropie -- omezenomezenáá volnost pohybu dvou molekul v roztokuvolnost pohybu dvou molekul v roztoku •• bez pbez přřííspspěěvkuvku entropieentropie •• reakce v rreakce v ráámcimci jedinjedinéé molekuly,molekuly, momožžnost volnnost volnéé rotace kolemrotace kolem ttřříí vazebvazeb •• daldalšíší omezenomezeníí volnostivolnosti pohybupohybu zrychlenzrychleníí 3 •• faktory pfaktory přřispispíívajvajííccíí k energii pk energii přřechodovechodovéého stavu:ho stavu: 2)2) solvatasolvataččnníí obal molekul vodyobal molekul vody, který obklopuje a stabilizuje, který obklopuje a stabilizuje biomolekuly ve vodnbiomolekuly ve vodnéém prostm prostřřededíí -- vazba substrvazba substráátu v aktivntu v aktivníím mm mííststěě vede k jeho desolvataci avede k jeho desolvataci a nnááhradhraděě vodvodííkových vazeb s pkových vazeb s půůvodnvodníí vodou interakcvodou interakcíí s enzymems enzymem 3)3) distorsedistorse čči deformace substri deformace substráátutu probprobííhajhajííccíí v mnoha reakcv mnoha reakcííchch 4)4) potpotřřeba vhodneba vhodnéé orientaceorientace u katalytických skupin enzymuu katalytických skupin enzymu -- tyto bariery pomtyto bariery pomááhháá snisnižžovat vazebnovat vazebnáá energieenergie •• enzym takenzym takéé ččáástesteččnněě mměěnníí konformaci pkonformaci přři vazbi vazběě sese substrsubstráátemtem -- "induced fit", Koshland, 1958"induced fit", Koshland, 1958 –– to umoto umožžnníí vznik slabých vazebných interakcvznik slabých vazebných interakcíí se substrse substráátemtem –– enzym zenzym zíískskáá novou katalyticky aktivnnovou katalyticky aktivníí konformacikonformaci KatalytickKatalytickéé skupiny enzymuskupiny enzymu •• po vazbpo vazběě substrsubstráátu se uplatntu se uplatníí funkfunkččnníí katalytickkatalytickéé skupiny pomskupiny pomááhajhajííccíí ššttěěpenpeníí aa vzniku vazeb rvzniku vazeb růůznými mechanismy:znými mechanismy: –– acidoacido--bazickbazickáá katalysakatalysa –– kovalentnkovalentníí katalysakatalysa –– katalysa s pomockatalysa s pomocíí kovovkovovéého iontuho iontu –– zahrnujzahrnujíí kovalentnkovalentníí interakciinterakci 4 AcidobazickAcidobazickáá katalysakatalysa reagujreagujííccíí lláátkytky produktyprodukty ššttěěpenpeníí amiduamidu bez katalysybez katalysy rychle zprychle zpěětt KdyKdyžž je pje přřenos protonu na/z voduenos protonu na/z vodu pomalejpomalejšíší nenežž rozpad intermedirozpad intermediááttůů, je stabilizov, je stabilizováána pouzena pouze malmaláá ččáást intermedist intermediáátu.tu. PPřříítomnost alternativntomnost alternativníích donorch donorůů (HA)(HA) čči akceptori akceptorůů (B:) proton(B:) protonůů zvýzvýšíší rychlost reakcerychlost reakce KdyKdyžž je pje přřenos protonu na/z voduenos protonu na/z vodu rychlejrychlejšíší nenežž rozpad intermedirozpad intermediááttůů, p, přříítomnost alternativntomnost alternativnííchch donordonorůů čči akceptori akceptorůů protonprotonůů nezvýnezvýšíší rychlost reakcerychlost reakce (obvykle to tak nen(obvykle to tak neníí)) pomoc katalyzpomoc katalyzáátoru ptoru přřekonatekonat nepnepřřííznivznivěě vznikajvznikajííccíí nnáábojeboje v prv průůbběěhuhu ššttěěpenpeníí amiduamidu vznik nvznik náábojbojůů se dse dáá obejobejíítt doddodáánníím protonu zm protonu z HH33OO++ (specifick(specifickáá kyselkyseláá katalýza)katalýza) nebo znebo z HAHA (obecn(obecnáá kyselkyseláá katalýza)katalýza) podobnpodobněě, n, nááboj se mboj se můžůžee neutralizovatneutralizovat OHOH-- (specifick(specifickáá bazickbazickáá katalýza) nebokatalýza) nebo B:B: (obecn(obecnáá bazickbazickáá katalýza)katalýza) Mnoho bioreakcMnoho bioreakcíí zahrnuje nestabilnzahrnuje nestabilníí nabitnabitéé intermediintermediááty, kterty, kteréé se rychlese rychle rozpadajrozpadajíí zpzpěět na výchozt na výchozíí reaktanty.reaktanty. IntermediIntermediááty lze stabilizovat pomocty lze stabilizovat pomocíí ppřřenosu protonu na/ze substrenosu protonu na/ze substráátutu nebo intermedinebo intermediáátu, cotu, cožž poskytneposkytne lláátky, ktertky, kteréé reagujreagujíí ochotnochotněě za vznikuza vzniku produktu.produktu. AcidobazickAcidobazickáá katalysakatalysa •• aminokyselinovaminokyselinovéé zbytkyzbytky úúččastnastnííccíí se acidobazickse acidobazickéé katalysy v aktivnkatalysy v aktivníích mch míístechstech enzymenzymůů •• ppřřesnesnéé prostorovprostorovéé umumííststěěnníí vv aktivnaktivníím mm mííststěě umoumožňžňujeuje efektivnefektivníí ppřřenosy protonenosy protonůů •• zvýzvýššeneníí reakreakččnníí rychlosti 100 arychlosti 100 ažž 101055 --krkráátt •• nejbnejběžěžnněějjšíší ppřříípad upad u biochemických reakcbiochemických reakcíí AAAA KyselKyseláá forma Zforma Záásaditsaditáá formaforma (H+ donor) (H+ akceptor) 5 LaktLaktáátdehydrogenasatdehydrogenasa •• AB katalysa pAB katalysa přři redoxni redoxníí reakcireakci N + H :N NHH CH3 O H OO NH2 NH2 NH + NAD+ laktát His Arg Pepsin (kyselPepsin (kyseléé proteasy)proteasy) •• ABK pABK přři hydrolysei hydrolyse NH R O R' O O H O O H O H Asp Asp peptid 6 LysozymLysozym •• hydrolysuje polysacharidovhydrolysuje polysacharidovéé řřetetěězce z bakterizce z bakteriáálnlníích stch stěěnn •• polysacharidy tvopolysacharidy tvořřeny z jednotek NAM a NAG (Neny z jednotek NAM a NAG (N-- acetylmuramovacetylmuramovéé kyseliny a Nkyseliny a N--acetylglukosaminu)acetylglukosaminu) •• hydrolysa glykosidickhydrolysa glykosidickéé vazby mezi C1 NAM a C4 NAGvazby mezi C1 NAM a C4 NAG LysozymLysozym •• jednotka D substrjednotka D substráátu je ptu je přřii vazbvazběě v napjatv napjatéé konformacikonformaci -- destabilizace, avdestabilizace, avššak celkovak celkověě pro vazbu jepro vazbu je ∆∆GG<0<0 •• stabilizace tranzitnstabilizace tranzitníího stavuho stavu komplex enzymukomplex enzymu se substrse substráátemtem (FEDCBA)(FEDCBA) 7 LysozymLysozym •• enzymovenzymováá kapsa vkapsa váážžííccíí hexamernhexamerníí oligosacharidovýoligosacharidový úúseksek (FEDCBA)(FEDCBA) LysozymLysozym •• ššttěěppíí se Cse C11--O vazba kruhu D (prokO vazba kruhu D (prokáázzááno pomocno pomocíí rad. znarad. značčenenéé vody)vody) •• GluGlu3535 lokalizovlokalizováán v nepoln v nepoláárnrníí ččáásti bsti bíílkoviny, Asplkoviny, Asp5252 v polv poláárnrníí •• GluGlu3535 funguje jako obecnfunguje jako obecnáá kyselinakyselina •• AspAsp5252 stabilizuje karboniový iont na D kruhustabilizuje karboniový iont na D kruhu •• po rozpo rozššttěěpenpeníí vazby zbytek s Evazby zbytek s E ččááststíí oddifundujeoddifunduje •• karboniový iont reaguje s molekulou vodykarboniový iont reaguje s molekulou vody •• GluGlu3535 (ionizovaný) nyn(ionizovaný) nyníí funguje jako obecnfunguje jako obecnáá bbááze pze přřijijíímajmajííccíí protonproton OO - Asp O OO O NH CH2 OH COCH3 COO- CH3 O + H H O O NAM NAG NAG Glu CC DD EE 8 B:XABX-A:XBA BABA OH OH 2 2 ++⎯⎯ →⎯+⎯→⎯+− +⎯⎯ →⎯− •• vznikvznikáá dodoččasnasnáá kovalentnkovalentníí vazba mezi enzymem avazba mezi enzymem a substrsubstráátemtem •• ppřřííkladklad -- hydrolysa vazby mezi skupinami A a B:hydrolysa vazby mezi skupinami A a B: •• ppřři kovalentni kovalentníí katalyse (enzym s nukleofilnkatalyse (enzym s nukleofilníí skup. X:)skup. X:) •• oba novoba novéé reakreakččnníí kroky muskroky musíí mmíít nit nižžšíší aktivaaktivaččnníí energii a být rychlejenergii a být rychlejšíší nenežž nekatalyzovannekatalyzovanáá reakcereakce •• mohou semohou se úúččastnit postrannastnit postranníí skupiny aminokyselin iskupiny aminokyselin i mnoha koenzymmnoha koenzymůů KovalentnKovalentníí katalysakatalysa NukleofilnNukleofilníí katalysakatalysa •• typicktypickéé propro serinovserinovéé proteasyproteasy (trypsin,(trypsin, chymotripsin, elastasa)chymotripsin, elastasa) •• Nu atak na uhlNu atak na uhlíík v karbonylovk v karbonylovéé skupinskupiněě COO- NNH R O N H R' OH Asp Ser His 9 NNH R O N H R' SH O NH2 Asn CysHis NukleofilnNukleofilníí katalysakatalysa •• typicktypickéé propro thiolovthiolovéé proteasyproteasy (papain, ficin,(papain, ficin, bromelain)bromelain) •• Nu atak na uhlNu atak na uhlíík v karbonylovk v karbonylovéé skupinskupiněě ElektrofilnElektrofilníí katalysakatalysa •• enzymy s pyridoxalfosfenzymy s pyridoxalfosfáátemtem •• a = transaminace, racemisace, dehydratace (oda = transaminace, racemisace, dehydratace (odššttěěpenpeníí beta hydroxylu)beta hydroxylu) •• b = dekarboxylaceb = dekarboxylace •• c = transhydroxylace (napc = transhydroxylace (napřř. serin p. serin přřejde na glycin aejde na glycin a zzíískskáá sese --CHCH--OH zbytek)OH zbytek) N + H CH3 O CH2O Pi HN + H N + H CH3 O CH2O Pi HN + H -OOC R H OH H NCH3 O CH2O Pi H N + H H-NH2 N C H2 E-Lys E-Lys + aa bb cc b,cb,c b,cb,c b,cb,c aa aa 10 Katalysa pomocKatalysa pomocíí iontiontůů kovkovůů •• kovy, bukovy, buďď pevnpevněě vváázanzanéé k enzymu, nebok enzymu, nebo zachycenzachycenéé z roztoku spolu se substrz roztoku spolu se substráátem, setem, se úúččastnastníí katalysy rkatalysy růůznými zpznými způůsoby:soby: –– iontoviontovéé interakce mezi kovem a substrinterakce mezi kovem a substráátemtem pompomááhajhajíí ke sprke spráávnvnéé orientaciorientaci –– stabilizujstabilizujíí tranzitntranzitníí stavy nesoucstavy nesoucíí nnáábojboj –– zprostzprostřředkovedkováávajvajíí redoxnredoxníí reakce reverzibilnreakce reverzibilníímimi zmzměěnami svnami svéého oxidaho oxidaččnníího stavuho stavu •• cca 30% enzymcca 30% enzymůů pro aktivitu vypro aktivitu vyžžaduje naduje něějakýjaký atom kovuatom kovu Kombinace dKombinace dííllččíích mechanismch mechanismůů •• vvěěttššina enzymina enzymůů poupoužžíívváá kombinaci nkombinaci něěkolikakolika katalytických strategikatalytických strategiíí pro zvýpro zvýššeneníí reakreakččnníí rychlostirychlosti •• chymotripsinchymotripsin -- napnapřřed obecned obecnáá acidobazickacidobazickáá katalysakatalysa nnáásledovansledovanáá kovalentnkovalentníí katalysoukatalysou