5. Kinetika reakce enzymu se substrátem
- parametry vHm (vmax) a KM, jejich význam
■ odvození rovnice Michaelise a Mentenové
■ metody stanovení parametrů MM rovnice
■ software pro enzymovou kinetiku
■ integrovaná forma MM rovnice
Rychlost (v) chemické reakce
A + B-^AB      v = *[A][B]
■ jednotky rychlosti: mol ľ1 s1
■ k... kinetická rychlostní konstanta, jednotky různé (s\ moľ1 I s1) - tak, aby vždy vyšly správné jednotky pro rychlost ,
a ;
■  měří se počáteční
rychlost (a) je správně
čas
Chemická rovnováha
A + B
^ Vl=^[A][B] -AB v_1=k_1[AB]
- rovnováha:     Vi = v^ = ^ [a] [B] = ^ [AB]
kinetická rovnovážná asociační konstanta:
kinetická rovnovážná disociační konstanta:
K,
[AB] _ kx
[A] [B] k_x
v     ĽA] [B]   k_x    „ , D     [AB]     ^ A
Řád reakce a molekularita
■ 0. řádu       v = kc° = k
■ 1. řádu       v = kc
■ 2. řádu       v = kc2 nebo   v = &cx
■ monomolekulární  a_>
■ bimolekulární
A + B-> neboA + A->
■ pseudomonomolekulární
A + B-> pokudA»B
např. A je voda
2
Enzymová reakce
■ rychlost závisí na koncentraci substrátu
■ pokud se za obvyklých podmínek ([E] ~ 1 nM, [S] ~ 0.1 až 1 mM) měří kolem 60 s, tak spotřeba substrátu dosáhne pouze několik procent - počáteční rychlost enzymové reakce
Reakce enzymu s jedním substrátem
E + S
ES
*E + P
-i
nejprve vzniká komplex enzym-substrát ES, který se následně rozpadá - buď za vzniku produktu, nebo zpět do výchozího stavu
■ zajímá nás rychlost vzniku produktu:
v = v = t[ES]
■ známe ale pouze výchozí koncentrace [E] a [S], koncentraci [ES] neznáme
■ předpoklad: vznik ustáleného Stavu
(steady-state), kdy se koncentrace ES v čase nemění (ale nevíme, jaká je...); zavedli 1925 Briggs a Haldane
■ platí, že rychlost vzniku ES je stejná jako rychlosti rozpadu:
V = V   + V
1 -12
3
Je ustálený stav oprávněný?
■ po krátké přechodové době (1 ms) ano
■ ...takže po dosazení: &,[E][S] = &JES3 + &JES]
■ zvážení látkové bilance enzymu:
[E] = [E]0-[ES] ^1([E]0-[ES])[S] = (^1+^2)[ES]
■ osamostatnění [ES]:      *,[E].[S]^[ES][S] = (^+*2ÍES]
^E]0[S] = [ES](^+*2+*,[S]) k[EUS] [E]n[S]
[ES]
K+K+k^S]    K+k2 | [g] k,
-> a dosazení do rovnice pro .       ,     . . v
rychlost vzniku produktu:    m*Ximaini rychlost Vmax
v = ^2[ES] = .^E^S]
Michaelisova konstanta Km
4
■ pokud je rozpad ES na produkt limitujícím krokem, tj. platí k2 « k_v tak se Km blíži výrazu kAlkv což je vlastně disociační konstanta KD pro komplex ES
■ (neplatí to ale příliš obecně...)
TABLE 6-6 Km	for Some Enzymes and Substrates	
Enzyme	Substrate	Km (niM)
Hexokinase (brain)	ATP	0.4
	D-Glucose	0.05
	o-Fructose	1.5
Carbonic anhydrase	HCO3	26
Chymotrypsin	Glycyltyrosinylglycine	108
	W-Benzoyltyrosinamide	2.5
ß-Galactosidase	D-Lactose	4.0
Threonine dehydratase	L-Tlireonine	5.0
Rovnice Michaelise a Mentenové
■ 1913 Leonor Michaelis a Maud Mentenová položili základy teorie reakce enzymu se substrátem
■ pro [S]=ACm dostáváme úpravou v= Vmax/2
■ pro [S]«ACm platí lineární závislost v={VmaxlKm)[S]
■ pro [S]»ACm je rychlost konstantní v= Vmax (saturace enzymu substrátem)
■ k2 se často nazývá kcat
■ poměr kcatIKm reprezentuje specificitu daného enzymu, vlastně má význam rychlostní konstanty: /
v = -ř[E]0[S]
V [S]
_ _max L J
~ K +[S]
5
Závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu
■ Vjjm ... limitní rychlost (občas alternativně)
■ Vmax ... maximální rychlost
J (^max-^)(^m+[S])=VrmaxACm ... rovnice hyperboly
Enzymy a difuse
^ = 1kJhr ^k,< kdlf = 4000xNA(DE + Ds)(rE + rs) Km    k_, + k2
■ pro výraz k2IKm je limitující rychlost vzniku komplexu ES, tj. konstanta fc,
■ ta je zase limitována četností srážek mezi molekulami enzymu a substrátu, danou konstantou km
■ některé enzymy dosahují katalytického maxima...
TABLE 6-8
				t/K,
Enzyme	Substrate	(s"1)	(M)	(M-V1)
Acetylcholinesterase	Acetylcholine	1.4 X 104	9 x io-5	1.6 X 10a
Carbonic anhydrase	C02	1 X 106	1.2 X 1(T2	8.3 X 107
	HC03-	4 X 105	2.6 X 1(T2	1.5 X 107
Catalase	H202	4 X 107	1.1 X 10°	4 X 107
C roto na se	Crotonyl-CoA	5.7 X 103	2 X 1(T5	2.8 X 10a
Fu m a rase	Fumarate	8 X 102	5 X 1(T6	1.6 X 10s
	Ma late	9 X 102	2.5 X 1(T5	3.6 X 107
j3-Lactamase	Benzylpenicillin	2.0 X 103	2 X 1(T5	1 X 10s
6
Jak určit parametry MM rovnice
ze závislosti počáteční rychlosti v0 na
(počáteční) koncentraci [S]
[S]	"o	chyba	15 -
1.0	5.2	0.4	
1.5	6.4	0.2	"o ■
2.0	8.1	0.6	10 -
3.0	9.5	0.5	
5.0	13.2	1	5 -
7.0	13.9	0.6	
10.0	14.8	1.2	0 -0
[S]
10
■ naměřená a znázorněná data
Klasické "grafické" metody
■ transformace MM rovnice na rovnici přímky y=a+bx
■ metoda dle Lineweavera a Burka - dvojnásobný reciproký výnos
- převrácená MM rovnice       1       +[S]     K 1
v~ vjs] ~v„[S] + y^
7
Další transformace
■ Eadie a Hofstee (Scatchard)
V
_ max
1
v
v max t v [š]	
	V max v—+■
■ Hanes a Woolf (reciproká MM rovnice x [S])
ÍS!=*k+_L[S]
v    V V
max max
Woolf, Augustinson a Hofstee (reciproká mm x vvmax)
v=V   -K —
max m j-^j
8
Nelineární regrese
■ programy pro zpracování vědeckých dat
■ zadají se naměřená data, zadá se vhodný model
■ program určí parametry tak, aby vypočtená závislost byla co nejblíže naměřeným datům (metoda nejmenších čtverců)
■ přímo implementováno v enzymologických programech
! E3
Software pro enzym, kinetiku
■ Dynafit
- NLLS analýza kinetiky (enzym, chem., ligand-receptor)
- vstupní data ([S],v0), nebo přímo časové záznamy
zadá se přímo model procesu včetně rychlostních konstant:
Monomer + Monomer <==> Enzyme    : k1 k2 Enzyme + Inhibitor <==> Complex : k3 k4 Enzyme + Substrate <==> ReactiveX : k5 k6 ReactiveX --> Product + Enzyme   : k7 k8
program konstanty určí, pod Windows, na bázi skriptů akademická licence zdarma
http://biokin.com/dynafit/index.html
9
Enzyme KineticsSPro
■  http://wvvw.chemsw.com/16029.htm   (300 USD, lze demo)
Ia ■     o B m s # li- _ Hi - p x )t ..i. I
další...
EZ-Fit
http://www.jlc.net/~fperrell/webps04.htm 250 USD
Systan - enzym, modul pro SigmaPlot http://www.systat.com/downloads/?sec=d0012
VisualEnzymics (SoftZymics) http://softzymics.com/index.htm 100 - 350 USD
Enzyme Lab - virtuální enzymová laboratoř, J. Chem. Educ. http://jchemed.chem.wisc.edu/JCESoft/lssues/Series_D/5D1/pro g1-5D1.html
"kádinka" s pufrem, enzymem a substrátem, míchadlo a fotometr
KINSIM (simulace) a FITSIM (hledání parametrů) http://www.biochem.wustl.edu /cf lab/message. htm I
Srovnání metod
■ jeden soubour naměřených hodnot ([S],v) byl vyhodnocen různými metodami, nalezené parametry:
Metoda	v 'max (umol M min1)	(mM)
Lineweaver-Burk	29 ± 15	2,9 ± 1,6
1/v - 1/[S]	(52)	(55)
Woolf, Augustinson, Hofstee, v - v/[S]	20,3 ± 4,9 (24)	1,7 ±0,6 (35)
Hanes a Woolf	27,3 ± 5,4	2,6 ± 0,7
[S]/v - [S]	(20)	(27)
Nelineární regrese	25,4 ± 4,0	2,33 ± 0,55
	(16)	(24)
■ zpracování má vliv na přesnost i správnost
Když probíhá zpětná reakce...
e + s^^es< ,   >-e + p
v = £2[ES]-£2[E][P] =    ^[S]   k~^m    [E]0 -> 2 ~2 *1[S] + *2[P] + *_1+*_2 0
■ za rovnováhy v=0:
Kjnq = ?majKm,s = k2iK
[S]
m,S
Knax / KM p       k_2l KM p
■ Haldanův vztah - souvislost mezi termodynamikou a kinetikou enzymové katalysy
11
Když není [S] konstantní...
■ úbytek substrátu v průběhu měření nelze zanedbat (> cca 5%) -neměří se počáteční rychlost
■ když reakce běží ireverzibilné (neprobíhá zpětná reakce), lze sledovat úbytek koncentrace substrátu - označí se x (platí vlastně x= [P] při stechiometrii 1:1)
■ sleduje se kontinuálně koncentrace substrátu (např. barevný fotometrický) v reakční směsi s enzymem
■ v určitých intervalech se zaznamená jeho úbytek
■ výsledek měření - soubor hodnot {t„ X|)
f„=0 ř, h x0=0
Integrovaná MM rovnice
do MM vztahu se dosadí aktuální koncentrace substrátu pro daný okamžik:
dx	_ ^ax([S]0-	-x)
v — dt		-x)
diferenciální rovnice, řeší se integrací
(separace proměnných, meze počátek [0,0] až po obecně [t,x])
II r^ + 1h = V-ídř oVL^-lo   x    j 0
í-KJn([S]Q-x) + irQ=VmííM
KJn-^^ + x = VmJ [S]0 - x
K An
[S]p [S]„ - [P]
+ [P] = VLxr
alternativní forma, záměna x = [P]
Integ. MM pro určení parametrů
■ provede se linearizace:
■ dostatek bodů se získá v průběhu jediného měření
lln     Elo      = K,ax        1 X
t   [S]0-*    Km Kmt
..... "max'^m
(í/ř)ln[([S]0)/([S]0-x)]
Další aplikace Integ. MM
- "plánování" enzymové reakce
- řešení otázek typu za jak dlouho zreaguje požadovaná část substrátu, kolik enzymu se musí přidat, aby
za daný čas s danou aktivitou zreagovalo žádané množství S
- vztah aktivita a max. rychlost:
[0,0]
(směrnice)
xlt
Prestacionárni kinetika
■ užitečná při řešení složitějších mechanismů
*.[s]([e]0-[es])
d[P]
dř
= £2[ES]
d[ES] át
= kl[E\[S]-(kl[S]+k_l+k2)[ES]
d2[P]   ř d[ES]
áf
= k
át
= ^[E]0[S] - (kt[S] +k_l+k2)k2[ES]
+ (k^S] + k_l+k2)d{P- WE]0[S] = 0 át át
■ pokud [S] = [S]0 = konst., tak lze integrovat
^lag
1
kl[S] + k_l+k2
prodleva