Inhibice enzymové aktivity ■ inhibitory = látky snižující specificky aktivitu daného enzymu J ztráta aktivity může být dočasná, aktivita se obnoví odstraněním inhibitoru (např. dialysa, gelová filtrace,...) = reverzibilní inhibitory ■ ireverzibilní inhibice = ztráta aktivity je nevratná (za normálních podmínek), aktivita obvykle ubývá postupně v čase Reversibilní inhibitory K, ES E + S + 1^ Kif + ES A 1^ E + P El Ku ESI----> El + P obecné schema reversibilní inhibice KĚS ... rovnovážná konstanta reakce enzymu se substrátem, obvykle platí KES ~ Km KIS... rovnovážná inhibiční konstanta (slope - směrnicová) Kň... rovnovážná inhibiční konstanta (intercept - úseková) plná inhibice (a=0), parciální inhibice (0 °° K, "úseková" [0,0] [I] [0,0] [I] dva sekundárni grafy - výnosy hodnot směrnic resp. úseků proti odpovídajícím koncentracím inhibitoru obecný postup pro všechny typy vratných inhibicí Akompetitivní inhibice ■ angl. uncompetitive ■ inhibitor se váže pouze na komplex ES a ne na volný E ■ v LB prim. výnosu se získá soubor rovnoběžek (Kis —> E + S y< —y - Stí y úseky [ I ] narůstá > směrnice stejné [l]=0 obvykle pozorováno u dvousubstrátových reakcí 1 1 K'm [0,0] J_ [Š] 3 Inhibice směsná a nekompetitivní ■ angl. mixed resp. noncompetitive ■ směsná inhibice je obecný případ, ■ K..*K. úseky AÍ^V-různé \/Aí—\± •' i íi ES + I ESI -> E ® [i]=o v K' [0,0] J_ [Š] ■ nekompetitivn inhibice je speciální případ, ■ K> = [ I ]50 ■ (vzácné) Kde bude průsečík? 4 Srovnání účinků vratných inhibitorů 01 23456789 10 [SyKrn J typ inhibice: ■ (a) směsná, [ I ] = K, = 0.5KU, menší V'ma = 0.67 Vmax, vyšší K'm= 2Km ■ (b) kompetitivní, [ I ] = K,s, V'ma = Vmax, vyšší K'm= 2Km ■ (c) akompetitivní, [ I ] = KVl; menší V'max= 0.5Vmax a K'm= 0.5Km ■ [dj mkoííi^ííUysú, [ I ] = K, = K„; menší V'ma = 0.5 Vmax, K"m= Km Inhibice substrátem (nadbytkem) ES E + S ES E + P ,, ma* [s] V — Ks = [ES][S] [ESJ S*. Ks ■ do aktivního místa se naváže druhá molekula substrátu ES, speciální případ akompetitivní inhibice Ks/Km Ukázka vlivu rostoucí Ks vzhledem ke K- bez inhibice, KsIKm» 100 Ks//Cm = 100 Ks//Cm = 10 KsIKm = 1 10C 10 [S]/Km 1 10 Ireversibilní inhibice ■ váží se kovalentně do aktivního místa ■ zničí skupinu aminokyseliny enzymu, která se účastní biokatalytické reakce ■ vznikne velmi pevná nekovalentní interakce (allopurinol a xanthinoxidasa) důležité pro studium průběhu enzymové reakce - lze tak určit, které aminokyseliny se na ní podílí ukázka reakce chymotrypsinu a diisopropylfluorfosfátu (DFP), vedoucí ke kovalentní modifikaci serinu v aktivním místě o Enz—CH2—OH + F-(Ser19B) H,C -0- -P I 0 1 H"CH3 o /CH3 CH \ CH3 DIFP CH, / Enz—CH?—O —P—O— CH I 0 1 H,C H CH, \ CH, Titrace enzymové aktivity irev. inhibitorem postupné přidávání inhibitoru, aktivita (resp. reakční rychlost) lineárně klesá s množstvím přidaného inhibitoru v "bodě ekvivalence" je látkové množství enzymu nE (resp. jeho aktivních míst) rovné látkovému množství přidaného inhibitoru n, lze tak jednoduše určit množství enzymu nE a např. DFP a cholinesterasa, těžké kovy a -SH skupina t t m • [0,0] [i] 6 "Sebevražedné" substráty normálně prakticky nereaktivní po navázání do aktivního místa enzymu proběhne část enzymové reakce, přičemž vznikne velmi reaktivní meziprodukt, co se kovalentně naváže v aktivním místě angl. "suicidal inactivators", nebo také "mechanism-based inactivators" cílený návrh léčiv - neškodné v buněčném prostředí, inaktivují pouze "svůj" specifický enzym -Variable group HC-i Glycopeptide transpeptidase Active enzyme -O Thiazolidiiie ring H^-V /CHs i i \hs — N- \ H^COO" Reactive peptide bond of ^-lactam ring podobný transitnímu stavu u norm, substrátu R i C = i HN HC- 0=C N-C i H H 0 1 Ser i Glyc opeptide transpeptidase Penícillayl-enzyme complex {enzyraatically inactive) CH3 -cocr Specifické značení enzymů ■ reaktivní skupina na analomi siihstratu něho inhibitoru Mřínova \m, § —_> j ■ Tag = značka (fluorescein, biotin, ...) 7 Activity-based enzyme profilling ■ srovnávací studie ■ mapování enzymového profilu Reactive „ Group Flucrophore/Biotm •. c Chemical Proba Protecme Probe-Labeled _Proteom&_ ■ In-Gel Analysis of Enzyme Activities »» G m<9 Inhibitor Library Activity. B«Wd Probo Protcome Inhibitor-Treated Proteome Probe-Labeled Protecme Inhibitors In-Gel Analysis Cílená modifikace postranních skupin 0,n ...... ■ E-NH \_ tnnitrobenzensulfonova (Lys)2 r-n=c=s ho3shQkno2 kyselina (subst.) isothiocyanát / aldehyd r-ch=0 (adice - thiomočovina) 02n (+ redukce borohydrjdem) ■ E-SH ^=n^ r (Cys) Cl-Hg^ \— COOH p.Chlormerkuri Q^N^O — benzoová k. 1-1 °2N ~~\V // S_S \v N°2 (ad'Ce maleimidy, např. NEM (adice) 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoová k.) HOOC COOH DTNB, Ellmanovo činidlo (substituce) ■ E--r^\ I^nh ,CO-OC2H5 /uíc\ Os diethylpyrokarbonát (alkoxylace) lni!>' CO-OC2H5 8 Cílená modifikace postranních skupin ■ E-OH fí/O-CHfCH^ /=Vr i f (Ser) f-pn W~8r8 V ' O—CH(CH3)2 O diisopropylfluorfosfát fenylmethylsulfonylfluorid DFP (fosforylace) PMSF (sulfonylace) ■ E~<^ />—oh c(N02)4 jj~ u N-acetylimidazol tetranitromethan n nai (acety|ace) \ 1 yO (nitrace) i co-ch, NH2+ o^CHa (Arg) NH* CHa U 2,3-butandion (kondenzace) fenylglyoxal (kondenzace) 9