Vícesubstrátové reakce
• v enzymové reakci se účastní dva nebo více substrátů, dvousubstrátové nejčastější
• sekvenční mechanismus
E + A + B -* AEB -* PEQ-* E + P + Q
- uspořádaný (napřed se váže A, pak B)
- náhodný (jako první se může vázat buď A, nebo B)
• ping-pongový mechanismus
E + A —	-» EA —	-> E'P ^—> E' -y> E'B —	-» EQ	—> E + Q
		l ( P B		
Sekvenční uspořádaný mechanismus
AE
AEB ^= OEP
OE
Q
Clelandova zjednodušená znázornění typické pro reakce dehydrogenas:
NAD+ + BEE>:
: NAD H + H+ + B
jako první substrát se váže NAD+, ethanol se na volný enzym neváže
NAD+ + CH3CH2OH
(A) ethanol
(B)
NADH + H+ + CH3CHO
(Q) acetaldehyd (P)
AĽ :
()[■
1.
ALB
T
1
Sekvenční uspořádaný
v =
^ax[A][B]
+ Km JA] + KmA [B] + [ A][B]
m,B
m,A I
• KA ... rovnovážná disociační konstanta pro reakci E + E = EA (vznik binárního komplexu)
• KmA a KmB ... Michaelisovy konstanty pro substráty A a B
• Vmax ... maximální rychlost pro [A] a současně [B]
1
v
K
m,A
v
max
f
V
Y _|_ KAKmB
i
+
i
f    K ^
Y | m,B
[A]   Vmax{ [B]
J
Kinetická analýza
		/[B]	
	1		^[B]\
	v		3[B]
	t 1 { //	/     1 (1-1	)
			
			1
			[A]
• primární LB grafy pro jeden substrát fixní (B), druhý variabilní -svazky přímek, pro které se určí směrnice, úseky
• sekundární grafy - výnosy směrnic, resp. úseků proti 1/[B], získají se přímky, z nich se pak určí příslušné konstanty (složité, lze najít v literatuře)
2
Sekvenční náhodný mechanismus
A + E
A F,
E + B EB
AEB QEP
QE ^ Q+ E
EP E + P
kreatinkinasa
ATP + E ATP:E
ATP:E:d ^= ADP:E:CrP
/ \
E + Cr E:Cr E:CrP
ADP:E -      AD P + E
E + CrP
H,N
H„N
(II,
\ I
c — N — CH.,— co< r
o
"O—P —N
H
/ CH,
\ I I        C—N—CH,—COO" O H.,N
Sekvenční náhodný
V =		^max[A][B]				
	^m,A^m,B ^m,B		[A] + ^mA[B] + [A][B]			
• •	oba primárni grafy mají opět charakter svazků protínajících se přímek interpretace pomocí reciproké formy					
1 V	_ Am,A ~ V max	(    K ^ Y | m,B l     [B] J	1 1 [A] + Vmax	(    K \ Y | m,B l     [B] J		
3
Ping-pongový mechanismus
• navázání prvního substrátu A
• uvolnění prvního produktu P
• vzniká pozměněná forma enzymu E"
• navázání druhého substrátu B
• uvonění druhého produktu Q
• nevzniká ternární komplex
EQ v — Ľ'E
AST
(ping-pong)
O COO" a-Ketoghitarate
Enzyme; pjTidoxainine coenzyme complex
(ET form)
glutamát:aspartátaminotransferasa
Ping-pongový
V =
KmB[A] + KmA[B] + [A][B]
l
V
Km,A    1     | 1
^max [A]   Vmax ^
^ ! iVm,B
[B] J
i
primárni vynos pro první substrát (A) má charakter rovnoběžek
Jak určit typ mechanismu
• rychlost isotopové výměny (viz minule)
• studium kinetiky reakce se substráty
- primární grafy - pokud dostaneme pro jeden ze substrátů rovnoběžky, tak se tento substrát váže první a jedná se o ping-pongový mechanismus
- pokud oba prim. grafy mají tvar protínajících se přímek - jedná se o sekvenční náhodný či uspořádaný mechanismus
• studium vlivu inhibice produkty
- do reakční směsi se přidá v nadbytku jeden z produktů, a zkoumá se jeho inhibice každému z obou substrátů
- formy enzymu, na které se váží substrát a inhibitor, jsou: shodné ... kompetitivní inhibice
různé, oddělené reversibilními kroky ... směsná inhibice různé, oddělené ireversibilními kroky ... akompetitivní inhibice
Možné mechanismy
1. E ^ EAB-►EPQ
EB^A
2. E + A—«-EA + B—» EAB ^ ' < E
3. E + B—►EB + A—►EAB
A ,P      B ,Q
^— FA    / . F'-^—E'B^"—
4, E -^-EA
B P      A Q
5. E -^EB E'—L^E'A^— E
Rychlost isotopové výměny - náhodný
• reakce hexokinasy: glukosa + ATP == glukosa-6P + ADP
• rychlost výměny rad. značené glukosy* a G6P (resp. ATP* a ADP) v závislosti na konsentraci G6P, za rovnováhy reakce
• monotónní nárůst obou rychlostí výměn svědčí o náhodném sekvenčním mechanismu
•   bez jednoho z reaktantů výměna [G6P] (mM)
neprobíhá - oba jsou potřebné [G]/[G6P] = 1/19 (rovnováha)
6
Rychlost isotopové výměny - sekvenční k
v
• reakce laktátdehydrogenasy
laktát + NAD+ == pyruvát + NADH
• obě výměny vychází z nulového stavu, prochází lokálním maximem, poté se
výměna pyruvát* - laktát ustálí, o 0.5 1.0
avšak výměna NAD+* - NADH       [laktát] (mM)
prakticky ustane [pyruvát]/[laktát] = 1/35 (rovnováha)
• mechanismus je sekvencí uspořádaný, první se váže NAD+, pak laktát, uvolní se pyruvát, nakonec NADH
• nadbytek laktátu vede k tomu, že enzym je převážně přítomen ve formě ternárního komplexu (EAB resp. EPQ), a v roztoku není přítomná volná forma E nutná pro vazbu NAD+ resp. NADH - tato výměna poklesne
Rychlost isotopové výmény - ping-pong
• izotopová výměna může probíhat i v tom případě, že schází druhý substrát
[0,0] [B]
• studium vlivu externích inhibitorů
- inhibitor se volí tak, aby kompetoval s jedním ze substrátů (A a lA - jsou strukturně podobné) = váží se oba na stejnou formu enzymu
- pak se zkoumá, jaký je projev inhibice vůči druhému substrátu B:
- akompetitivní - napřed se váže substrát B, pak substrát A
- směsná, resp. nekompetitivní - napřed se váže substrát A, pak substrát B
* ea
b y
B
eab
Příklad:
lA... kompetuje s A, nekompetitivní vůči B lB ... kompetuje s B, akompetitivní vůči A