Kooperativní efekty
■ kooperativita - interakce biomakromolekuly (obvykle tvořené z podjednotek) se 2 a více Ugandy
■ vazba prvního Ugandu usnadní (znesnadní) vazbu dalšího Ugandu - pozitivní (negativní) kooperativita
■ 1910 - objevil Hill pozitivní kooperativitu při vazbě kyslíku na hemoglobin
■ alosterie - vlastnost biomolekuly změnit strukturu při vazbě Ugandu do nesubstrátového místa
Hillova rovnice
frakční saturace Y:
M + nl_ == MU
[MLJ
1
[L]"
[MLJ + [M]
[M] [MLJ
1 +
1 +
K     K + [L]n
[Lf
upravit:
[Lf
l-Y
K
a log:
log
l-Y
= «log [L]-log Ä'
- Hillův graf... výnos log[Y7(1-Y)] proti log[L]
-> jeho směrnice ... Hillův koeficient nH
■ pozitivní kooperativita ... nH>1 (max. hodnota koeficientu udává minimální počet interagujících podjednotek n) {n a nH jsou různé pojmy!)
negativní kooperativita
nH<1
1
Rozšíření teorie na enzymy
■j 1963Monod:   E + nS == ES„
K =
[E][sr
studium kinetiky na základě počáteční rychlosti enzymové reakce
[ESJ [E]0
■ grafické projevy:
sigmoidni ^ kinetika~~
ŕí
[L]
log
Vymax-Vy
= «log[S]-log£
1/Y
1/[L]
MWN model (Monod, Wyman, Changeaux)
každá podjednotka enzymu má buď vysokou (R) nebo nízkou (T) afinitu k substrátu v molekule enzymu mají vždy všechny podjednotky stejnou konformaci (všechny v T, nebo všechny v R)
bez substrátu převládá T, přejde-li v přítomnosti substrátu jedna z nich na R, tak se stanou všechny R přechody mezi T a R stavy mohou způsobit i jiné efektorové molekuly:
dvě formy: T... tensed R... relaxed
íl""
alosterický inhibitor
aktivátor (heterotropní)
2
Pňklad alosterie - fosfofruktokinasa
■ fruktosa-6-fosfát + ATP === fruktosa-1,6-bisfosfát + ADP
■ alosterický aktivátor - AMP
■ alosterický inhibitor - ATP
■ ukázka přímého výnosu reakční rychlosti:
[ f ruktosa-6-fosfát ]
Analýza pomocí Scatchardova výnosu
■ enzym jVJ tvořen z n podjednotek m (tj. M ~ mn), každá m má 1 vazebné místo pro Ugand L (substrát, inhibitor, aktivátor, ...)
■ probíhá postupná interakce s ligandem:
mn + L == mnL   mnL + L == mnL2 ... m,,^., + L == mnLn
■ experimentální studium:
- směs volného enzymu (výchozí koncentrace [E]0) a volného Ugandu ([L]0)
- nechá se ustavit rovnováha a určí se koncentrace volného Ugandu [L]
- koncentrace vázaného Ugandu je pak [L]v = [L]0 - [L]
- koncentrace zbylých volných vazebných míst za rovnováhy:
[m] = [m]0 - [L]v = n[M]0 - [L]v
■ průměrný rozsah vazby r (platí: 0 < r < n), je to vlastně podíl koncentrace obsazených vazebných míst a celkové koncentrace enzymu, tj. r=[Ly[M]0
3
Vazebná místa v M se neovlivňují
■ lze uvažovat jedinou rovnováhu:
m + L == ml_      a příslušnou disoc. konstantu:
K
[m] [L] [mL]
lze upravit pomocí předchozích definovaných koncentrací aj.
g=(n[M]0-[L]v) [L]v
n
\r )
[L]
dále lze modifikovat do tvaru analogického saturační kinetice enzymové reakce: vyhodnocuje se linearizací dle Scatcharda:
n[L] K + [L]
r/[L]
směrnice = -1//C
[L]
[0,0] 1
výsledek:
počet podjednotek n disociační konstanta K
Vazebná místa se ovlivňují
■ projevy: sigmoidní kinetika r/TL]
určí se n, K určit nelze
[0,0]
vyhodnocení - použije se Hillova rovnice upraví se na tvar: zlogaritmuje:
[L]
r =
n[L]nH
(aK) + [Lf»
r =tL]n" n - r (aK)
log
í  r \
nH log[L]-log^
Vliv pH na aktivitu
■ důvod:
disociace skupin účastnících se enzymové reakce
aktivita
kombinace disociačních závislostí pak určuje konečný vliv na aktivitu
interpretace na úrovni kinetiky
pomocí vlivu na parametry o.o
K a V
nm "max
obsah BH+ .0 • — -
obsah A~
7
pH
10
Vliv pH na enzymovou reakci
■ molekuly enzymu, substrátu i komplexu enzym-substrát obsahují disociující skupiny
■ ve vodném prostředí za daného pH vystupují jako různé formy lišící se množstvím vázaných protonů (např. enzym je přítomen ve formách EH2, EH a E)
■ ze všech daných forem však pouze jedna forma substrátu reaguje s jednou formou enzymu (zde EH) za vzniku komplexu enzym-substrát
■ pouze jedna z forem komplexu (zde EHS) pak reaguje na produkt
eh2s
*1
v1es
IÍ
s +
eh +
K
2E
K,
±:ehS'
2ES
-*eh + p
es
-j podíl žádané formy (např. EH) lze vyjádřit jako:
/eh
[EH]
1
1
[E] + [EH] + [EH2]   JEX + 1+[EH1]    [H+] K2E
[EH]
[EH] K
1E
[H+]
■ obdobný vztah platí i pro EHS a nebo pro substrát, pokud disociuje
■ po zlogaritmování lze pak uvažovat krajní hodnoty výsledného výrazu pro různé meze pH:
log/EH =-log
[H+] iU K2E
V ^1E
[H+]
■ lze dále odvodit, že:
pH-log^
1E
0
-pH + log/ř
2E
pH nízké pH kolem 7 pH vysoké
v  =v f
max        max-' EHS
Á fl
EHS
a dále po zlogaritmování: pX = -logX)
lze interpretovat závislosti obou parametrů na pH
mm
aproximací závislostí pak lze určit hodnoty pACdisociujících skupin
informace o aktivním místě enzymu
EHS
P^m = P^m - lOg /EHS + lOg /j
'EH
j \ log/^
'HJ-J
p/C1ES    p/C1E     pK2E    pK2ES pH
6
Interpretace
■ nalezené hodnoty pK pro skupiny v aktivním místě se porovnají s tabelovanými rozsahy pK pro známé aminokyseliny
■ při shodě lze usuzovat, že v aktivním místě se vyskytuje daná aminokyselina
■ praktický význam zjištění pH optima - nalezení nejvhodnějších podmínek pro enzymovou reakci -dosažení nejvyššího výtěžku
Vliv teploty na enzymovou reakci
obecně chemické reakce běží rychleji při zvýšení teploty na druhou stranu biomolekuly při vyšší teplotě ztrácí aktivní konformaci a denaturují (náhodná struktura klubka) výsledkem je existence individuálního teplotního optima pro každý enzym
0.6
0.4
0.2
0.0
zvýšení	
	
aktivity při	
růstu teploty r	
M	
	
0       10     20     30     40 50
tm
7
Vliv doby inkubace
Temperature (°C)
■ kratší inkubační čas při enz. reakci vede k posunu teplotního optima k vyšším teplotám
■ delší čas inkubace za dané teploty má opačný vliv
Vliv teploty na stabilitu
Time (min)
■ při vyšší teplotě ztrácí enzym aktivitu mnohem rychleji
■ pokles je velmi strmý v důsledku rel. vysoké AG 200 až 300 kJ/mol, takže po překročení kritické teploty je denaturace velmi rychlá
Vliv teploty na kin. konstanty
kinetické rychlostní konstanty - Arrheniova rovnice:
k = A exp
v
RT
■ rovnovážné konstanty - vant Hoffova rovnice:
■ často v alternativním tvaru:
\nK = ^ + AS RT
ln— = AH
1 1
T T
Praktické aspekty
■ enzymy uchováváme v chladu
■ dlouhodobě zmražené, vyvarovat se opakovanému zmrazování a rozmrazování
■ přidat kryoprotektivní činidla (glycerol, polyoly -manitol)
■ přesné (1%) měření rychlosti vyžaduje temperaci lepší než 0.1 °C
■ teplotní kvocient O10 - kolikrát se zvýší reakční rychlost, jestliže teplota vzroste o 10 °C (obvykle kolem 2)
9